化瘀消癥杀胚中药复方诱导人输卵管妊娠滋养细胞凋亡的影响

摘要：目的　探讨化瘀消癥杀胚中药复方对人输卵管妊娠滋养细胞增殖、凋亡的影响。方法 用中药复方水煎剂处理人输卵管妊娠滋养细胞，设未经中药复方处理的细胞为空白对照组，采用CCK8法检测不同给药浓度、不同给药时间细胞增殖情况；用中药复方高、中、低剂量处理人输卵管妊娠妊娠滋养细胞，设未经中药处理的细胞为空白对照组，48h后采用Hoechst染色法、流式细胞术（flow cytometry, FCM）检测细胞凋亡情况。结果 与空白对照组相比，各浓度中药复方对人输卵管妊娠滋养细胞增殖均有明显的抑制作用，呈浓度、时间依赖性。48h IC50为27.86 mg/ml；中药高、中、低浓度组中人输卵管妊娠滋养细胞呈现典型的凋亡形态学改变，其凋亡率分别为（24.57±1.08）%，、（18.30±1.18）%、（14.37±2.64）%，与空白对照组（9.57±0.76）%相比明显增加（F=47.88，Ρ=0.00）。结论 化瘀消癥杀胚中药可能通过抑制人输卵管妊娠滋养细胞增殖，促进细胞凋亡从而达到治疗输卵管妊娠的目的。
关键词：异位妊娠；中药复方；人输卵管妊娠滋养细胞；细胞凋亡
基金资助：国家自然科学基金（No.81173295）

　　近些年来，随着盆腔感染史、盆腔手术史、人流患者的增多，异位妊娠（ectopic pregnancy，EP）发病率呈逐年增长的趋势，占所有怀孕总数的1%-2%。其中约98%发生在输卵管[1]。中医公认异位妊娠的发病机理是少腹血瘀证[2]，临床上应用化瘀消癥杀胚中药复方治疗早期输卵管妊娠成功率达88.9%[3]，最大限度保全了患者的生育功能，提高了生活质量。本实验研究化瘀消癥杀胚中药复方对人输卵管妊娠滋养细胞增殖、凋亡的影响，从而为化瘀消癥杀胚中药复方治疗输卵管妊娠提供理论依据。
1　材料  主要试剂：DMEM/F12培养基及胎牛血清、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；DNaseⅠ、Triton、Hoechst33342购自Sigma公司；Cytokeratin18、Anti-C-erbB-2和Vimentin抗体购自Abcam公司；CCK 8购自南京建成公司；Annexin V-FTTC细胞凋亡试剂盒购自上海贝博生物公司。
2　方法
2.1人输卵管妊娠滋养细胞的体外培养
2.1.1 取材 未使用药物、直接手术治疗的早期输卵管妊娠患者的绒毛组织，在严格无菌下从输卵管中取出，用生理盐水冲洗表面附带血液，即刻送实验室。
2.1.2人输卵管妊娠滋养细胞的原代培养及纯化 将绒毛组织反复洗涤3次后，剪碎至1-3mm³。加入等体积的25%胰蛋白酶及0.1% DNaseⅠ后，于37℃恒温水域箱内振荡消化15-20min，加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，吹打1min，200目孔径不锈钢滤网过滤；800r/min，离心5min，弃上清；加入无血清DMEM/F12悬浮至3ml。用Percoll密度梯度法纯化，吸取云雾状中层细胞置于50ml离心管内，加入4倍体积DMEM/F12，800r/min离心5min，弃上清；细胞计数仪计数，以无血清的DMEM/F12培养基调整细胞数为5×10⁸ L^-1，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，1h后取出换瓶，加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养。24h首次换液，后每隔48h换液一次。当细胞长满瓶底90%时传代，传代过程中用差异贴壁法（同上）达到细胞纯化的目的。
2.1.3免疫荧光激光共聚焦显微镜鉴定人输卵管妊娠滋养细胞 传代至第四代后，25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基将细胞接种于预先放有盖玻片（多聚赖氨酸包被过）的六孔板中继续培养，待细胞长满70%-80%后用4℃的甲醛固定15min；用预冷的PBS洗3次，再用0.1%trition室温透膜5min；PBS洗3次后每孔加入1ml 5%山羊血清封闭，室温孵育20min；分别滴加100μl稀释的（1:100）Cytokeratin18抗体、Anti-C-erbB-2抗体和Vimentin抗体，室温孵育1h；PBS洗3次，滴加稀释的荧光二抗，室温避光孵育1h；PBS洗3次，滴加DAPI的抗荧光淬灭封片剂滴于载玻片上，封固，置于-20℃过夜凝固；激光共聚焦显微镜上观察细胞形态及纯度。
2.2 中药制备 化瘀消癥杀胚中药复方由丹参15g、赤芍15g、桃仁15g、紫草15g、天花粉15g组成，取2剂共150g。将化瘀消癥杀胚全方药材粉碎成粗粉，用8倍水加减煎煮2次，每次1h，合并滤液，调整PH值至中性，浓缩定容至1000ml，其原液浓度为0.15g/ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。分装后-20℃保存备用。
2.3 化瘀消癥杀胚中药复方对人输卵管妊娠滋养细胞增殖的影响 采用CCK8 法。将滋养细胞接种于96孔板中，37℃孵育24h、48h、72h；实验组：加入5mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml中药复方（中药复方原液用无血清DMEM/F12培养基稀释）；空白对照组：直接加入无血清DMEM/F12培养基。每组设9个复孔。
2.4 化瘀消癥杀胚中药复方对细胞凋亡影响的形态学观察 采用Hoechst染色法。将滋养细胞接种于6孔板中，待细胞长满80%时，加入5mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml中药复方，并设空白对照组，37℃孵育48h；弃上清，PBS冲洗2次，加入Hoechst（用DMEM/F12培养基按1:1000比例稀释），37℃避光孵育30min，置倒置荧光显微镜下观察。
2.5 化瘀消癥杀胚中药复方对细胞凋亡影响的检测 采用流式细胞术。收集5mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml中药复方及空白对照组处理48h的滋养细胞，分别加入400μl Binding Buffer重悬后，加入5μl Annexin V-FTTC，4℃避光孵育15min后加10μl PI 4℃避光孵育5min，混匀上流式细胞仪检测。
2.6 统计学方法 每组实验至少重复3次，统计学处理采用统计软件包SPSS17.0，数据均以表示，药物组间比较采用完全随机设计的方差分析，以P<0.05为有统计学意义。
3　结果
3.1人输卵管妊娠滋养细胞的分离、培养
原代滋养细胞接种后可见较大的圆形细胞悬浮，24h后大部分细胞贴壁，悬浮的多为形态较小的血细胞，48h后可见少量散在细胞伸展，7天后细胞数量明显增多，细胞呈三角形、类圆形，部分联合成片，呈铺路石子样。原代生长较慢，约20天-30天长满90%，可以传代。原代培养细胞多夹杂成纤维细胞，传代时先回缩变圆多为成纤维细胞，其他细胞约5min脱壁，传代后细胞生长速度明显增加，约4天-7天爬满瓶底。
3.2人输卵管妊娠滋养细胞的鉴定
结果显示，体外培养的人输卵管妊娠滋养细胞表达抗CK-18阳性、Anti-C-erbB-2阳性，染色后胞浆分别染为绿色和红色；抗Vimentin阴性，胞浆不染色。按上述方法检测分离纯化后的输卵管妊娠滋养细胞纯度为90%以上，可用于下一步实验。结果见表1.

表1.人输卵管滋养细胞免疫荧光细胞化学染色结果

Tab.1  Immunofluorescence cytochemistry staining results of human tubal pregnancy nourishing cells

注：角蛋白为上皮细胞特异表达蛋白；抗波形蛋白阳性者为间质细胞特异表达蛋白；Anti-C-erbB-2阳性证明所培养的滋养细胞中具有侵袭性的绒毛外滋养细胞（EVCT）成分存在。
3.3化瘀消癥杀胚中药复方对人输卵管妊娠滋养细胞增殖的影响
　　CCK8法测定结果表明，与空白对照组相比，不同浓度的中药复方对滋养细胞作用24h、48h、72h后对其细胞增殖均有抑制作用，且滋养细胞增殖抑制作用随着中药复方药物浓度的增加，作用时间的延长效果越明显，呈时间、剂量依赖性关系，见图1。中药复方在48h对滋养细胞的IC50为27.86 mg/ml，因此，本文选择20mg/ml、10 mg/ml、5 mg/ml中药复方处理48h后的滋养细胞进行后续实验。

3.4 化瘀消癥杀胚中药复方诱导人输卵管妊娠滋养细胞凋亡形态学改变
倒置荧光显微镜下观察可见，不同浓度中药复方组中均出现不同程度细胞体积缩小，细胞皱缩，核固缩，核碎裂及凋亡小体，以20 mg/ml浓度组最明显。见图2.

3.5 化瘀消癥杀胚中药复方对人输卵管妊娠滋养细胞凋亡的影响 
流式细胞仪检测结果显示，5mg/ml、10 mg/ml、20mg/ml浓度组细胞凋亡率分别为（14.37±2.64）%、（18.30±1.18）%、（24.57±1.08）%，与空白对照组（9.57±0.76）%相比，10 mg/ml、20mg/ml浓度组细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义（F=47.88，Ρ=0.00）。见图3.

4 讨论
4.1体外培养滋养细胞的建立
　　体外滋养细胞的培养大致分为组织贴块法和胰酶消化法。组织块培养法简单易行，但所得目标细胞量少，难以纯化。目前大多数学者采用胰酶消化法 ，可在短时间内得到大量高纯度的细胞，但必须严格掌控胰酶的浓度和消化时间，减少细胞损伤。本实验采用胶原酶、胰酶联合消化，减少了胰酶对细胞的损伤。妊娠早期的绒毛组织主要为滋养层细胞、成纤维细胞，夹杂少量血管内皮细胞、Hofbauer细胞及血细胞等[4]，如何排除其它细胞成分而保留所需成分是培养成功的关键，目前滋养细胞纯化的方法有BSA梯度法、Percoll密度梯度离心法、差异贴壁法、淋巴细胞分离液法等。其中以Kliman[5]等的Percoll连续密度梯度分离纯化法最为经典，分离纯化滋养层细胞的纯度可达90%以上[6]。文献报道[7]滋养层细胞在Percoll中所处的密度为1048-1062g/L，而成纤维细胞在Percoll中所处的密度为1035g/L以下[7]，我们以次为依据，将分离梯度简化为2层，即30%(密度为1040g/L)60%(密度为1080g/L)，分离滋养细胞，得到较多的原代细胞。再利用细胞对胰酶敏感性不同及贴壁速度不同在传代时进行滋养细胞纯化，此外Hofbauer细胞及血细胞均属非贴壁细胞，在换液过程中皆可除去。重复以上操作，传至4代时爬片鉴定，鉴定结果示CK18、阳性、Vimtin阴性者占90%以上。
4.2化瘀消癥杀胚中药复方对滋养细胞的影响
　　异位妊娠是早期孕妇死亡的主要原因之一。中医认为异位妊娠的发病机理是少腹血瘀证，采用活血化瘀、消癥杀胚方药治疗早期输卵管妊娠疗效确切。早在1958年山西医学院第一附属医院首先使用宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠，取得突破性进展。化瘀消癥杀胚中药复方是根据中医理论而制定，由丹参、赤芍、桃仁、天花粉、紫草五味药组成，是宫外孕Ⅰ号方衍化而来。本实验以人输卵管妊娠滋养细胞为研究对象，采用CCK8法证实了化瘀消癥杀胚中药复方对体外培养的人输卵管妊娠滋养细胞增殖有明显的抑制作用，其抑制作用呈剂量和时间相关性；而经不同浓度化瘀消癥杀胚中药复方处理的人输卵管妊娠滋养细胞采用流式细胞分析仪Annecin Ⅴ FITC/PI双标记法、Hoechst染色法从不同角度证实了化瘀消癥杀胚中药复方诱导人输卵管妊娠滋养细胞的假设。
　　早期滋养细胞有潜在的侵袭活力和自我凋亡能力，在胚胎发育过程中，适度的细胞凋亡有利于绒毛内血管和分支形成，对胚胎的正常发育具有积极保护作用[8]。异位的滋养细胞无控制的侵袭输卵管粘膜层及凋亡引导失败，最终导致输卵管管壁的破裂出血[9-10]，而不同于正常的宫内妊娠，孕早期凋亡在输卵管妊娠中发生在绒毛膜比底蜕膜中明显[11]，诱导人输卵管妊娠滋养细胞的凋亡是治疗的关键。本实验证实化瘀消癥杀胚中药复方可诱导人输卵管妊娠滋养细胞的凋亡，为临床上采用化瘀消癥杀胚中药复方治疗输卵管妊娠提供了理论依据。
　　中药复方因其成分复杂，一直是中医药现代化研究的重点与难点之一。目前采用的方法有血清药理学法和直接添加法，这两种方法各有其优缺点。血清药理学法能更好的模拟中药复方在体内代谢的过程，但其含药血清成分复杂，增加了质控难度，且血清中本身固有活性物质对实验结果的影响无法去除，最终影响实验结果。近些年来，直接添加法在中药复方的体外实验中得到广泛应用[12-13]，其优势在于可以更好的控制受试药物主要成分质量，较稳定的进行药物量效观察，易于重复[14]。本研究采用中药直接添加法证实了化瘀消癥杀胚中药复方有抑制人输卵管妊娠滋养细胞增殖，诱导其凋亡的作用，但复方中的哪些有效成分通过何种凋亡途径起到促凋亡作用，尚有待进一步的研究探索。

参考文献　略