异位妊娠患者中医体质调查以及化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠影响的研究

中文摘要

引言：

　　受精卵在子宫腔以外着发育床称为异位妊娠，包括输卵管妊娠，宫颈妊娠，宫角妊娠，腹腔妊娠，其中以输卵管妊娠最常见[1]。近年来，由于人工流产手术增多[2]，患者趋于年轻化，有不洁的性生活、盆腔感染史和盆腔手术史患者增多，异位妊娠发病率明显增加，据资料统计，异位妊娠发病率占所有已知怀孕总数的1%[3]以上。其中，未婚、未生育患者也明显增加。随着现代检测技术的进步和妇科医生对本病警惕性的提高，输卵管妊娠的早期诊断率已大大提高，为非手术治疗创造了条件，使得这部分患者避免了因手术而引起身体创伤和经济压力，同时最大限度的保留了患者的生育能力。   
　　非手术治疗中，中医药治疗现已广泛应用于临床。中医认为，异位妊娠的发病机理是少腹血瘀证，治疗上采取活血化瘀、消癥杀胚为法。自山西中医学院第一附属医院首先使用宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠以来，各地在宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方的基础上临证加减，均取得了较好的疗效。然而，中医药治疗异位妊娠的治法、方药、疗效等虽屡见报导，但对中药治疗的作用机理研究尚处于初级阶段，多数研究仅停留在血液流变学的层次上，没有特异性的、系统层次的研究说明其作用靶点及其作用机理。

1.临床研究
目的：
　　研究异位妊娠妇女的体质类型分布，以正常未孕妇女作为对比，探讨异位妊娠患者体质类型分布特点，以及异位妊娠自然流产？？发生的高危体质，为今后通过中医药干预和调节育龄期妇女孕前体质，降低异位妊娠的发病率作前期研究。
研究方法：
对2011年1月至2012年3月在广州中医药大学第一附属医院妇科住院的异位妊娠病人，并以正常未孕妇女作对照，根据王琦教授设计的九分法中医体质调查表，进行现场问卷调查。
研究结果：
（1）病例收集：对住院的异位妊娠患者共发放调查问卷178份，入院诊断为异位妊娠者经初步排查后发放调查问卷，根据出院诊断再次筛查，剔除诊断不明者及合并有其他疾病者，最后收集有效病例159份。正常未孕妇女组共收集122例。
（2）在159例异位妊娠患者当中，阳虚质居多，其次为气郁质和瘀血质。经LogistiC回归分析，对异位妊娠的发生有显著影响的变量有瘀血质和湿热质（P<0.01）。
2.基础实验研究
目的：
　　本实验拟通过高效液相--质谱（HPLC-MS）联合分析方法，作为血清药理学运用的质控方法，证明灌服中药后的大鼠含药血清中中药成分群的存在。并从雌孕激素受体及基质金属蛋白酶方面探讨化瘀消癥杀胚中药复方（宫外孕Ⅰ号方加味）对输卵管妊娠滋养细胞靶器官的作用机制。
研究方法：
　　拟采用高效液相--质谱（HPLC-MS）联合分析方法，分别对化瘀消癥杀胚的中药复方进行中药复方指纹图谱分析、对灌服中药复方后的SD大鼠血清及空白SD大鼠血清进行检测并定性差比分析。用经质控证实含有化瘀消癥杀胚中药成分群的大鼠含药血清，对符合纳入条件的输卵管妊娠患者的输卵管妊娠滋养细胞进行体外培养，并分别设MTX对照组及空白对照组进行体外培养。采用实时荧光定量（Real-time），测定化瘀消癥杀胚中药复方对与输卵管妊娠相关的调节因子ER、PR、MMP表达的影响，从分子基因水平上探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞靶器官的可能作用机制。

研究结果：

(1)化瘀消癥杀胚中药复方的高效液相指纹图谱 

　　与7个标准品溶液的高效液相指纹图谱对比，化瘀消癥杀胚中药复方的高效液相指纹图谱出峰较多，其中6个峰的滞留时间完全相符。
(2) LC-MS/MS法检测化瘀消癥杀胚中药复方给药血清的药物成分
　　在灌服化瘀消癥杀胚中药复方后的SD大鼠血清中找到瓜氨酸、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、苦杏仁苷、芍药苷。而甲氨蝶呤组和生理盐水组的含药血清中不含有上述任何一种药物成分。
(3)化瘀杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞ER、PR、MMP的影响
①中药中剂量组和甲氨蝶呤组米非司酮？?能显著下调ER的表达。甲氨蝶呤组与生理盐水组相比，ER的表达更低，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；中药中剂量组与生理盐水组相比，er的表达更低，差异具有统计学意义（p<0.05）；甲氨蝶呤组与中药中剂量组相比，er的表达略低，差异无统计学意义（p>0.05）。
②中药中剂量组和甲氨蝶呤组米非司酮??能显著下调PR的表达。甲氨蝶呤组与生理盐水组相比，PR的表达更低，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；中药中剂量组与生理盐水组相比，pr的表达更低，差异具有显著统计学意义（p<0.01）；甲氨蝶呤组与中药中剂量组相比，pr的表达略低，差异无统计学意义（p>0.05）。
③中药中剂量组和甲氨蝶呤组米非司酮??能显著上调MMP的表达。甲氨蝶呤组与生理盐水组相比，MMP的表达明显上升，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；中药中剂量组与生理盐水组相比，mmp的表达上升，差异无统计学意义（p>0.05）；甲氨蝶呤组与中药中剂量组相比，MMP的表达上升，差异无统计学意义（P>0.05）。

研究结论：
1.阳虚质、气郁质、血瘀质、湿热质等是异位妊娠的高危体质。
２.异位妊娠患者的体质多为虚实夹杂。
3.活血化瘀消癥杀胚中药复方的高效液相指纹图谱表明，其中药复方内含有组方的所药物成分（丹参、赤芍、桃仁、紫草、天花粉）。
4.LC-MS/MS法检测化瘀消癥杀胚中药复方含药血浆药物成分的实验证实，中药含药血清中含有上述化瘀消癥杀胚的中药成分。这些成分是化瘀消癥杀胚中药治疗输卵管妊娠的药效基础。
5.化瘀消癥杀胚中药复方能降低ER、PR的表达，表明其能从受体水平拮抗雌孕激素，导致绒毛组织变性、坏死。是其发挥消癥杀胚效应的作用机制之一。
６.化瘀消癥杀胚中药复方能上调MMPs的表达，加速输卵管蜕膜的溶解，导致蜕膜组织变性、坏死。也是其发挥消癥杀胚效应的作用机制之一。

关键词 中医体质调查；化瘀消瘾杀胚复方；输卵管妊娠；实验研究

引  言

　　异位妊娠指受精卵在子宫腔以外着发育床，包括输卵管妊娠，宫颈妊娠，宫角妊娠，腹腔妊娠，其中以输卵管妊娠最常见[1]。近年来，由于人工流产手术增多[2]，患者趋于年轻化，有不洁的性生活、盆腔感染史和盆腔手术史患者增多，异位妊娠发病率明显增加，据资料统计，异位妊娠发病率占所有已知怀孕总数的1%[3]以上。其中，未婚、未生育患者也明显增加。
　　本研究拟通过调查异位妊娠妇女的体质类型分布，找出其中的规律，发现异位妊娠发病的易感体质，以此为据，通过中医药干预和调节育龄期妇女的孕前体质，以期降低异位妊娠的发病率。
　　对于异位妊娠的治疗，随着现代检测技术的进步和妇科医生对本病警惕性的提高，输卵管妊娠的早期诊断率已大大提高，为非手术治疗创造了条件，使得这部分患者避免了因手术而引起身体创伤和经济压力，同时最大限度的保留了患者的生育能力。   
　　非手术治疗中，中医药治疗现已广泛应用于临床。中医认为，异位妊娠的发病机理是少腹血瘀证，因冲任胞脉、胞络不畅，致运送孕卵受阻，不能移行至子宫，或先天肾气不足，后天脾气受损，脾肾气虚不能把孕卵及时运送至子宫，导致孕卵在输卵管内发育。治疗上采取活血化瘀、消癥杀胚为法。自山西中医学院第一附属医院首先使用宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠，各单位即在宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方基础上临证加减，均取得了较好的疗效。导师邓高丕教授根据多年临床研究总结出的一整套异位妊娠评分标准和治疗方案，通过中西医结合和多途径用药，取得良好的疗效。然而，中医药治疗异位妊娠的治法、方药、疗效等虽屡见报导，但对中药药物治疗的作用机理研究尚处于初级阶段，多数研究仅停留在血液流变学的层次上，没有特异性的、系统层次的指标说明其作用靶点及其作用机理。
　　本实验拟通过高效液相--质谱联合分析方法（HPLC-MS）分别对化瘀消癥杀胚的宫外孕复方进行中药复方指纹图谱分析、对灌服宫外孕复方的SD大鼠血清及空白SD大鼠血清进行检测并定性差比分析，作为血清药理学运用的质控方法，证明大鼠含药血清的有效成分群的存在。
用经质控证实含有化瘀消癥杀胚有效物质的大鼠含药血清，对符合纳入条件的输卵管妊娠患者的输卵管妊娠滋养细胞进行体外培养，并分别设MTX对照组及空白对照组进行体外培养。采用实时荧光定量（Real-time）测定化瘀消癥杀胚的宫外孕复方对与输卵管妊娠着床的相关调节因子ER、PR、MMP表达的影响，从分子基因水平上系统探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞靶器官的可能作用机制。

第一章   文献研究

第一节 异位妊娠的中医药研究进展

　　异位妊娠指受精卵在子宫腔以外着床。其中以输卵管妊娠最常见[1]。目前，输卵管妊娠发病率升高，严重影响女性的生殖健康。尤其是未婚、未生育患者明显增加, 这些病人在治疗方式的的选择上对于保留患侧输卵管有着强烈的愿望；同时随着现代检测技术的进步和妇科医生对本病警惕性的提高，输卵管妊娠的早期诊断率已大大提高，为非手术治疗创造了条件。非手术治疗中，中医药治疗现已广泛应用于临床，其治法、方药、疗效等屡见报导，但对中药药物治疗的作用机理研究尚处于初级阶段，多数研究仅停留在血液流变学的层次上，没有特异性的、系统层次的指标说明其作用靶点及其作用机理。
一、中医病因病机
中医学认为输卵管妊娠的发病机理与少腹瘀滞，冲任胞脉、胞络不畅，致运送孕卵受阻，不能移行至子宫，或先天肾气不足，后天脾气受损，脾肾气虚不能把孕卵及时运送至子宫，孕卵在输卵管内发育，以致破损脉络，阴血溢于少腹，发生血瘀、血虚、厥脱等一系列证候，其病机本质是少腹血瘀证[4]。
二、中医药治疗异位妊娠概况
（一）宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方加减
　　关于中医药治疗异位妊娠，目前有大量的文献报导，综合各类文献，可以看出中医药治疗异位妊娠疗效较为满意。自山西中医学院第一附属医院首先使用宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠，各单位即在宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方基础上临证加减，广泛应用于临床。许志芃等[5]用宫外孕II号方加味治疗异位妊娠，选择符合西医妇产科学第六版适合保守治疗的异位妊娠患者随机分成两组，观察组口服宫外孕II号方加味，对照组肌注MTX，结果两组总有效率及血β-HCG下降时间无明显差异（P＞0.05）。许爽君等[6]运用宫外孕II号方加味治疗异位妊娠51例，治愈43例，无效8例，治愈率为84.31%；其中血β-HCG≤5000IU/L者45例中，治愈40例，治愈率为88.89%。
（二）基本方加减
　　刘佳[7]报道应予自拟宫外孕汤，方药组成：丹参15g，赤芍12g，桃仁12g，红花12g，三棱12g，莪术12g，夏枯草30g，紫草18g，天花粉30g，贯众15g，蜈蚣2条。临症加减：包块明显者加浙贝、玄参、生牡蛎；出血较多者加炒蒲黄、五灵脂、三七粉；腹痛胀满者加枳壳、木香、川楝子；孕卵存活不化者加全蝎、穿心莲，每日1剂，水煎分早中晚3次饭后温服。服药期间每周复查血HCG及B超，，以判断是否有效，并指导用药。48例宫外孕患者经过治疗后，治愈45例，无效3例，治愈率为93.8%。
　　江梦华[8]运用活络灵丹(乳香、没药、赤芍、丹参、桃仁)加味，杀胚加天花粉、蜈蚣、水蛭、紫草，止痛加延胡索，消结加三棱、莪术、山甲、夏枯草和川牛膝，瘀血化热者加皂角刺、王不留行、丹皮、龟板、生地、旱莲草和地骨皮等。中药治愈率为88%，血或尿HCG降至正常的时间为(11±4.5)d，异位妊娠包快完全吸收的时间为(30±15)d。对18例要求生育者待治愈后行输卵管造影术患测输卵管通畅16(88.9%)，其中9例宫内妊娠，1例再次异位妊娠。
（三）分期辨证论治
　　吴新华[9]以化瘀止血方（生蒲黄9g（包）、三七粉3g（冲）、茜草15g、地榆炭15g、山楂12g、延胡索9g、鸡内金6g、连翘15g、炙甘草6g）为基本方，分三期（即胚胎存活期、胚胎发育停止早期、包块形成期）辨证论治，胚胎存活期在化瘀止血方的基础上加紫草、蜈蚣、天花粉、白花蛇舌草等杀胚中药，同时配合米非司酮（20 mg，口服，日2 次，连服2 d），以达到快速杀死胚胎同时改善局部微循环的目的；胚胎发育停止早期在化瘀止血方基础上加用益母草、红藤、生薏苡仁、败酱草等祛瘀利湿、清热解毒，减少渗出，加快局部炎症包块吸收，减少粘连；在化瘀止血方基础上加党参、黄芪、焦白术、皂角刺、浙贝母、水蛭等以益气消癥，使气畅癥消，有利于胚胎的排出及病情的恢复。
　　黄少妮等[10]运用宫外孕2 号方加减三步骤保守治疗。主方：三棱、莪术、赤芍、丹参、桃仁各10g。第一步，从发现异位妊娠始，即以杀胚、降HCG 为主，主方加天花粉30g，蜈蚣2条，贯众、紫草各15g。第二步，HCG 已较明显下降，本无阴道出血者出现阴道出血量多，或就诊时便有阴道出血且时间已经较长、淋漓不尽时，以止血佐活血化瘀为治则，可予加蒲黄15g，五灵脂、茜草各10g等。第三步，阴道出血已止，HCG 已正常或将近正常，但附件包块仍存在者，以活血化瘀消癥块为治疗大法，加用徐长卿15g，皂角刺、路路通、土鳖虫各10g 等。其次根据具体辨证用药，气血亏虚可加党参、黄芪、鸡血藤；脾虚湿盛、胃肠不舒加紫苏叶、陈皮；便溏者去桃仁加木香、白芷；气滞血瘀甚者加香附、丹参等；总有效率达91.43%。
（四）中西医结合治疗
　　宁艳辉等[11]以肌内注射甲氨蝶呤（MTX），200 mg/次，1次/d，共7天，血清β- HCG超过2 000 ng/ml加用米非司酮25 mg/次，3次/d，共7天。同时服用活血化瘀，杀胚散结中药：当归15g，川芎10g，丹参根15g，天花粉30g，三七10g，莪术10g，桃仁15g，红白芍15g，皂角刺各15g，败酱20g，蜈蚣（头和脚）20g，没药20g。随症加减：恶心、呕吐加干橙色果皮100g？?；腹泻加茯苓150g？？，泽泻100g？？时血清β-HCG降至正时？？，蜈蚣、天花粉、加水蛭100g？？。治疗异位妊娠526例，治愈率达92.39%。血清β-HCG下降至正常的时间是12～39天（包括5例10 000 ng/ml血清β- HCG的，下降到正常的35～39天时间），盆腔包块吸收325例4周内，8周吸收者108例，54例12周内吸收。
　　叶金花等[12]报道以甲氨蝶呤( MTX)75mg 加入生理盐水100ml中, 微泵静注，1小时滴完; 米非司酮片50mg, 每日2次。同时口服中药, 处方: 丹参15g, 天花粉、赤芍各12g, 桃仁、莪术、红花、三棱、炒蒲黄、川芎各10g, 甘草6g，每日1剂, 水煎早晚服。5天为1个疗程。104 例保守治疗患者中, 84例保守治疗成功( 其中10 例经过2 个疗程治疗), 治愈率为80.8%，住院时间最短7天，最长28 天。
（五）其他疗法
　　其他疗法有中药针剂静脉注射，如活血化瘀之丹参注射液；活血化瘀消癥散结之中药水煎剂保留灌肠，中药粉剂调和后外敷下腹部；中成药亦以活血化瘀消癥散结为原则，常用药物有血府逐瘀胶囊、散结镇痛胶囊、大黄庶虫丸、桂枝茯苓丸等，此外，章雪莲报导妇科千金胶囊有利于改善和促进局部的血液循环, 促进炎性渗出物的吸收, 从而消除炎性包块及慢性粘连, 较快的改善子宫位置及输卵管病变,以使机能恢复正常, 有效地防止再次异位妊娠的发生，其配合抗生素治疗异位妊娠包块有效率可达91.94%。

三、活血化瘀消癥杀胚中药研究进展
　　自山西中医学院第一附属医院首先使用活血化瘀杀胚之宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠, 并取得突破性进展。此后, 各地医院在上方的基础上，采用中医或中西医结合的方法保守治疗异位妊娠，已有较大进展。中医药治疗异位妊娠的总治则为活血化瘀杀胚。常用的有以下药物[13]：
　　丹参：能活血祛瘀，止痛消痈，宁心安神。现代药理发现其含脂溶性非醌类成分，具有抗凝、促进纤溶，抑制血小板聚集，抑制血栓形成，有改善血液流变，抑菌、消炎的作用，此外还可增强机体免疫力。据《中国药典》2005版[14]，丹参的主要药效成分为丹参酮ⅡA和丹酚酸B，采用HPLC对丹参的鉴别和质量监控亦以此为标准品，丹参酮ⅡA色谱条件：色谱柱为C18色谱柱，流动相为甲醇-水，检测波长为270nm；丹酚酸B色谱条件：色谱柱为C18色谱柱，流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水，检测波长为286nm。
　　桃仁：能活血化瘀，润肠通便。现代药理发现其能抗炎，促进产后子宫收缩，抗血栓形成，对血流阻滞、血行障碍有改善作用。桃仁的主要药效成分为：苦杏仁甙，采用HPLC[15]对桃仁的鉴别和质量监控亦以此为标准品，其色谱条件：色谱柱C18色谱柱，检测波长210nm，流动相磷酸盐缓冲液-甲醇。
　　赤芍：能行瘀止痛，清热凉血，活血消肿。现代药理发现其有解痉，抗血小板凝集，抗凝抗血栓形成作用。据《中国药典》2005版，赤芍的主要药效成分为赤芍甙，采用HPLC对赤芍的鉴别和质量监控亦以此为标准品，赤芍甙色谱条件：色谱柱为 C18色谱柱，流动相为甲醇-磷酸二氢钾，检测波长为230 nm。
　　天花粉：能清热泻火，生津止渴，消肿排脓。现代药理研究表明，天花粉蛋白有致流产和抗早孕作用。天花粉蛋白[16]能够迅速作用于胎盘合体滋养细胞，催化细胞内核糖体失活，抑制细胞内蛋白质合成，导致细胞死亡，绒毛合体滋养层变性坏死，细胞解体，其碎片阻塞血窦，造成血液循环障碍，组织坏死， 内分泌功能受损，血、尿HCG下降，胚胎死亡而达到终止妊娠之目的。沈丽芳[17]报道，以天花粉结晶蛋白治疗符合保守治疗条件的宫外孕患者38例，治愈率97.37％；杨泽星[18]等以天花粉蛋白注射液治疗异位妊娠52例，治疗成功率90．0％《中国药典》2005版，天花粉的主要药效成分为瓜氨酸，采用HPLC对天花粉[19]的鉴别和质量监控亦以此为标准品，瓜氨酸色谱条件：色谱柱为 C18色谱柱，流动相为硫酸，检测波长为210 nm。
　　紫草：能清热凉血，活血，解毒透疹。紫草含有乙酰紫草醌、紫草醌等，有一定的抑制滋养细胞生长和分化的作用。李欣等[20]用复方紫草汤治疗异位妊娠38例，总有效率95％。邢恺[21]等待的化学实验中低浓度的复方紫草汤溶液培养液就可以观察到绒毛细胞早期凋亡，较高浓度的复方紫草汤溶液培养液则直接可引起绒毛细胞坏死或裂解，证明复方紫草汤溶液的刺激对绒毛细胞的凋亡有明显作用。动物实验示紫草单味水煎剂喂养的大白鼠，子宫内膜呈退行性变，孕囊呈明显出血及大片坏死变性，隐见蜕膜样内膜。说明紫草具有影响滋养层细胞使孕囊变性坏死的作用。杨柳等[22]运用紫草乙醇提取物对体外培养人绒毛组织，发现其能显著抑制体外培养的人绒毛组织分泌HCG的功能，破坏绒毛组织结构，甚至使其坏死。据《中国药典》2005版，紫草的主要药效成分为左旋紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁，采用HPLC对紫草的鉴别和质量监控亦以此为标准品，左旋紫草素[23]色谱条件：色谱柱为 C18色谱柱，流动相为乙腈-水-乙酸，检测波长为275 nm；β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁色谱条件：色谱柱为 C18色谱柱，流动相为乙腈-水-乙酸，检测波长为516 nm。
　　此外，常用于异位妊娠保守治疗的中药有[13]三菱、莪术、香附、川芎、丹皮等。现代药理研究发现[24]活血化瘀药物可改善病灶周围的血液循环, 抑制血小板聚集, 对血凝块的分解和吸收有一定作用; 还可以抑制组织异常增生, 既可以阻止血肿包块的形成, 又可促进已形成的包块吸收消散。清热解毒药物可以抗炎抑菌, 对急性渗出性炎症有显著的抑制作用, 并可降低组胺等引起的毛细血管通透性增加；另一方面, 清热解毒药可提高机体的免疫功能, 增加抗体的抗病能力, 与活血化瘀药一同作用可以预防感染, 减少粘连,加快输卵管功能的恢复。

　　据报导[25]，中药治疗宫外孕，主要是利用药物的杀胚作用及活血化瘀类药物，如丹参、赤芍、三棱、莪术等调动巨噬细胞吞噬功能的作用，以杀死胚胎，促进包块吸收。另据报道宫外孕Ⅰ号方（丹参、赤芍、桃仁）能促进纤维蛋白原在肝脏合成, 降低血浆纤溶酶的溶解活性，抑制赖氨酰氧化酶活性，起到凝血和防止出血的作用，可用于破裂后仍有少量内出血或腹腔内血液未凝成血肿包块者。宫外孕Ⅱ号方（丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术）可提高血浆纤溶酶活性和血浆胶原酶活性，促进单核巨噬细胞机能，促进腹腔淋巴管对血浆蛋白的吸收，促使宫外孕包块尽快吸收消散，用于治疗未破裂型及破裂后无继续内出血，腹腔内血液已凝成血肿包块者。
　　以上可以看出，中药治疗输卵管妊娠主要利用中药的化瘀消癥杀胚能调动巨噬细胞的吞噬作用改善血液循环，使病变局部血管扩张，增加血容量，改善组织缺氧状态，减少胶原纤维合成，提高腹膜通透性并促进胶原酶活性，提高纤溶酶活性，使机化组织变软，利于血肿与妊娠物的吸收，可缩短治疗时间，提高治愈率，特别适合于迫切要求保留生育能力的早期输卵管妊娠患者。

第二节  中医药治疗异位妊娠的优势

　　近年来，由于人工流产手术增多[2]，患者趋于年轻化，有不洁的性生活、盆腔感染史和盆腔手术史患者增多，异位妊娠发病率明显增加，未育妇女异位妊娠的发病率也不断增加。据资料统计，异位妊娠发病率占所有已知怀孕总数的1%[3]以上，其中大部分为输卵管妊娠（95%）。目前，临床上常用的治疗方法有手术治疗及中西医保守治疗。随着测定血β-HCG方法灵敏度的增强，腹部及阴道三维超声联合检查以及妇产科医师对异位妊娠的高度警惕，80％的异位妊娠可以在未破裂前得到诊断，早期诊断给保守治疗创造了条件。选择经济、有效的治疗方式，提高治疗后宫内再孕率一直是医生和患者们共同的追求。中医药在以上方面即有相关的优势：
一、费用较低廉
　　众所周知，手术治疗的住院费用明显高于保守治疗者。据报道[26]，手术治疗（以腹腔镜为例）宫外孕平均每例的费用（① 直接医疗费用：包括疾病治疗的住院费用(包括治疗出现并发症时的进一步处理费用)及相关门诊治疗费用；② 直接非医疗费用：患者及家属的交通费用和患者的特殊饮食费用；③ 间接费用：包括患者和家属因病休息或陪护影响工作的费用，这些费用按照误工天数乘以每天的平均收人计算）明显高于保守治疗者，手术治疗患者的住院时间明显短于保守治疗者，但患者本人的误工时间（住院时间+出院后恢复至工作时间）及其家属的误工时间明显长于保守治疗者，而两者的有效率无明显差异。黄小清[27]等对比药物（甲氨蝶呤+四氢叶酸）保守治疗与开腹手术，两者的输卵管畅通率、异位妊娠复发率、宫内妊娠成功率与对照组比较差异均无统计学意义；而药物保守治疗的住院时间短于对照组，住院费用明显少于对照组，差异均有统计学意义。因此，药物保守治疗尤适合正处于经济发展中的中国。
二、有效且副作用小
　　保守治疗有西医治疗及中医药治疗。西医治疗常用的药物有甲氨蝶呤及米非司酮等。其治疗异位妊娠疗效确切，但毒性较大（消化道反应、骨髓抑制、药物性皮疹、脱发、药物性肝炎、肾功能障碍等）。据报道[28]，甲氨蝶呤联合米非司酮治疗宫外孕的毒性反应（主要为呕吐、腹痛、肝功能损害、白细胞下降等）发生率为31%，单用甲氨蝶呤治疗宫外孕的毒性反应发生率为35%，单用米非司酮治疗宫外孕的毒性反应发生率较小，亦有14%。陈欣等[29]则报道：单用甲氨蝶呤治疗宫外孕的毒性反应发生率为14.2%，甲氨蝶呤联合米非司酮治疗宫外孕的毒性反应发生率为12.9%。中医药治疗宫外孕，其可调节机体免疫功能，改善局部血液循环，阻止滋养细胞和胚胎的生长，使异位妊娠病灶加快坏死、吸收，明显缩短病程；同时药物通过适当炮制、配伍，选用适当剂量，可减少或避免其毒副反应的出现，在此方面亦鲜有报道。其与西药联用，不仅可以增强疗效，通过适当的药物配伍还能减轻或消除西药的毒副作用。
三、保留生育能力，提高治疗后宫内再孕率
　　传统的异位妊娠治疗方法为手术治疗，包括剖腹或腹腔镜下患侧输卵管切开取胚或输卵竹切除术。多数患者在治疗后，盆腔粘连，输卵管受损，生育能力下降[30]。而药物作用不仅避免了因手术造成的瘢痕及周围组织粘连，还能使异位妊娠组织溶解和吸收，故采用药物治疗后输卵管复通率、妊娠率高于剖腹或腹腔手术者。由此可见药物治疗尤其适合要求生育的年轻患者，或曾经异位妊娠手术不愿再次手术者。
　　在药物保守治疗保留了患侧输卵管的基础上，中医药与西药相比，其在促进输卵管妊娠包块吸收，促进促进患侧输卵管复通方面有显著优势。宋雅丽等[31]报导：对经B超和血HCG(清绒毛膜促性腺激素)确诊并适合进行保守治疗的135例宫外孕患者随机分为治疗组和对照组, 分别给与中药加西药(治疗组)和单纯用西药(对照组)进行保守治疗.通过定期,行血HCG、B超和恢复3次月经后的HSG(子宫输卵管造影)检查作为衡量疗效与预后的指标, 观察妊娠肿块吸收和输卵管恢复通畅情况，并分别比较两组结果。结果显示，治疗组85例, 初次恢复月经后有61例包块消失, 包块吸收率为71.76%；对照组50例, 初次恢复月经后有6 例包块消失, 包块吸收率为12%；第三次恢复月经后子宫输卵管造影检查, 治疗组患侧有66例通畅, 输卵管复通率为77.65%；对照组有5例通畅, 输卵管复通率为10% 。两组对比, 治疗组初次月经恢复后包块吸收率和输卵管复通率与对照组相比均有极显著意义（P<0.01）。由此可见，中药能够协助杀胚、降HCG, 在促进盆腔循环代谢、消肿块, 恢复输卵管通畅方面具有显著效果。因此，中医药确实不失为治疗异位妊娠的安全有效并经济的治疗方式。
　　异位妊娠为现代医学病名，在中医古籍的“妊娠腹痛”、“胎动不安”、“胎漏”、“癥瘕”等病证中亦有类似症状的描述。目前，中医认为其发病机理是少腹血瘀证[4]，故多采用活血化瘀、消癥杀胚方药对早期输卵管妊娠进行治疗。应用由宫外孕Ⅰ号方（丹参、赤芍、桃仁）加紫草、天花粉组成的化瘀消癥杀胚的宫外孕复方对符合适应症的输卵管妊娠患者治疗，已取得较好的临床疗效，治疗成功率达88.9%[32]，使这部分患者避免了因手术而承受的痛苦，减少了术后并发症，同时最大限度保全了患者的生育功能。
    

第三节  中药及复方的质量鉴定

　　到21世纪，世界各国呼唤“回归自然”，转而寻求天然药物。中药具有资源丰富、取材于自然、毒副作用较少等特点，其优势在国际上逐渐突显，中药的多成分、多靶点和整合效应逐步成为国内外学者的基本共识。中药成分极其复杂，尤其是复方。复方中药质量的稳定是复方疗效稳定的前提和基础。复方中药的质量受多种因素的影响，如原药材的产地、品种、等级、采收季节、复方制剂的制备工艺等。而复方中药的化学成分更加复杂，测定少数几种有效成分或指标成分，不足以保证复方及制剂质量，必须借助先进的分析技术进行质量控制。
一、中药指纹图谱
　　传统的中药鉴别方法是性状鉴别，通过观看、摸、闻、尝等直观方法考察中药的形、色、气、味，以进行经验鉴别及品质优劣的经验判断，这是我国中医药工作者丰富经验的总结。近年来，许多新技术和仪器已用于中药的鉴定和质量控制，如色谱技术：薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、超临界色谱、高效逆流色谱；光谱技术：紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振（NMR）；质谱技术（MS）、热分析技术、电泳技术等。
中药指纹图谱现已成为研究复方中药药效物质基础的重要方法，它是指某种（或某产地）中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段得到的能够标示其特性的色谱或光谱的图谱。指纹图谱的应用，原国家药监局副局长任德权将它称之为“中药质量控制的里程碑”。在有效成分不完全明确的前提下，制定中药材和复方中药制剂的指纹图谱，表征中药的特性，表达成品的质量，以达到对工艺操作和原药材的质控。建立系统的测定方法和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹图谱的可操作性、可控、稳定、显性和量化的目的，以提高中药质量控制的水平[33]。谢培山认为中医药理论和实践的非线性特点要求综合评价中药质量，分析化学由分解、微观向宏观、综合分析转变将成为必然的趋势，色谱指纹图谱(图像)分析是对中药材及其制剂进行综合宏观分析的可行手段之一[34]。罗国安等将多维多信息特征图谱应用于中药分析鉴定中，建立中药注射剂多维多信息特征图谱，可系统完整地解决药效和质量相关性问题,获得了满意的结果[35]。在诸多指纹图谱分析法中，高效液相色谱法(HPLC)具有定量精密度高，分析速度快，稳定性好，检测器种类多等特点，不受样品挥发度和热稳定性的限制，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，目前已成为构建指纹图谱的主要方法之一。
二、液质联用
　　中药复方是一个极其复杂的化学体系，其组分从原始药材中各种无机物到有机物，小分子到大分子，主要成分到微量成分，组成极其复杂。复方在煎煮的过程中相互发生化学反应，汤剂在进入人体以后经过代谢又产生了新的物质，而复方的药效基础包括以上所有的化学成分。对如此复杂的化学体系实现快速准确的分离分析是现代方剂研究的难点，而液质联用技术正适用于此。
　　质谱的原理[36]是选择一定质量的离子通过一级质谱(MS1)，使其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体(常用气体为He，Ar，Xe，CH4等)进行碰撞诱导裂解，发生离子--分子碰撞反应，产生子离子，再经二级质谱(MS2)进行分析。质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。液质联用是以高效液相色谱为分离手段，以质谱为鉴定工具的一种分离分析技术。它将高效液相色谱对复杂样品的高分离能力与质谱具有的高选择性、高灵敏度以及能够提供分子量与结构信息的优点结合起来，从而实现对中药复方复杂的化学体系实现快速准确的分离分析。

　　液质联用[37]可以对微量样品或样品中的微量成分进行定性定量分析，采用LC/MS或者LC/MSn，得到总离子流图及各个组分的各级质谱图，并且与标准化合物的保留时间、质谱中的准分子离子峰及特征碎片峰等对比，在无现成标准品的情况下，直接参考文献，根据样品组分的分子量信息，特别是由串联质谱得到的特征碎片离子或中性丢失等结构信息，可以快速鉴定方剂中的化学成分，并进行定量分析。

　　液质联用[37]不仅可以快速鉴定中药中的已知化学成分，而且能快速鉴定未知化学成分。由于中药提取物中的同类化合物在化学结构很相似，因此可以对数个已知单体化合物进行质谱裂解分析，研究这一类化合物的裂解特征以及结构上的细微差异引起的裂解行为的不同，总结出基于结构特征的质谱碎裂规律，然后利用这个规律，根据这类化合物未知成分的质谱裂解特征直接推断其化学结构。
　　此外，液质联用[38]还应用于复方的药代动力学研究。复方化学成分复杂，吸收进入体内后经过代谢发生一系列生物转化，其代谢产物在体内含量低微，且受复杂基质干扰（介质效应），故而识别药物在体内的代谢过程极为困难。LC/MSn技术结合液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度和极强的定性专属性，对血浆或血清样品，对照标准品，可以鉴定药物成分在体内有无变化，并且对药物代谢产生的移行成分能够进行结构鉴定。
 
第四节 异位妊娠ER、PR、MMP的研究进展
一、ER、PR、MMP与宫内早孕的研究
（一）ER、PR与宫内早孕的研究

　　众所周知，雌孕激素对于早期妊娠的维持起着至关重要的作用。其主要影响子宫内膜的发育及子宫内膜容受性。而E、P 的生理效应有赖于ER、PR的介导， 因此, E、P及其受体中的任何一个因素表达失常均可能导致着床失败[39]。 雌激素在转录水平诱导ER、PR产生, 使ER、PR表达上调, 而孕酮可在转录和转录后水平使两者下调, 两者保持动态平衡和精细的比值以维持继续妊娠[40]。对排除内分泌疾病的不孕患者子宫内膜ER、PR 得研究显示[41], 内膜异常组ER 显著低于正常组, 提示ER异常是引起内膜发育异常的关键因素；另有研究表明[42]，PR 在胚泡着床过程中同样起着重要作用。ER 和PR 表达下降导致子宫内膜容受性下降, 胚泡不能着床或胚胎着床后发育不良导致流产。因此，子宫内膜上ER、PR 减少是引起不孕和早期流产的重要因素。

　　郑瑞芹等[43] 对多囊卵巢综合征( PCOS)早期自然流产患者及输卵管性不孕患者的子宫内膜雌激素受体( ER)、孕激素受体( PR) 进行检测，两组患者均于月经干净3-7d时在宫腔镜下取子宫内膜标本，结果显示，PCOS患者子宫内膜ER 和PR 的表达强度较输卵管性不孕组明显减弱, 提示PCOS患者子宫内膜ER、PR 含量减少, 可能是其自然流产的重要原因。而蒋晓莉[44]等对药物流产患者的绒毛组织进行检测，证明米非司酮对绒毛滋养细胞中仍ER、PR有显著的降调节作用, 表明米非司酮可在受体水平拮抗孕酮, 促进绒毛滋养细胞变性、坏死及凋亡从而达到抗早孕的目的。
（二）MMP与宫内早孕的研究

　　在胎盘的形成过程中，滋养层细胞依靠自分泌和蜕膜组织协调分泌的蛋白水解酶及其抑制因子的协调作用,穿过子宫内膜上皮及血管基膜,进而在母体组织中迁移和浸润。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一类重要的组织蛋白水解酶，能够降解细胞外基质，在胚胎植入、胎盘形成及维持正常妊娠中发挥重要作用。子宫内妊娠滋养层细胞及母体蜕膜细胞均表达MMPs2、9、14和MMPs抑制因子TIMP1、2、3[45]。在生理状态下，MMP与TIMP之间维持相对的平衡状态，对于细胞的浸润及转移能力有重要影响, 一旦两者之间的比例失调, 就会造成一系列的病理状态。

　　关于MMPs在自然流产者绒毛组织中的表达尚有分歧，Iwashashi[46]等研究了自然流产蜕膜组织中胶原的含量, 发现IV型和V 型胶原的含量明显低于正常分娩者, 因此推测IV型和V 型胶原含量的降低是由于MMP-2 和MMP-9过量表达的结果。Jokimaa[47]、谭兵兵[48]、王乾兴[49]等分别检测到绒毛组织中MMP-2的表达量明显高于人工流产组(P<0.01)，MMP-9无明显差异，提示自然流产组MMP-2处于高表达状态。因此推测, 在早孕期内, 由于MMP-2活性增高又导致子宫蜕膜基质降解过度, 从而使尚未完全形成的胎盘从宫腔的剥离提前发生, 可能是早期自然流产发生的原因之一；而张素娥等[50]检测到绒毛组织中MMP-2的表达量明显低于正常早孕组(P<0.01)，张宏等[51]检测到早期自然流产组绒毛组织的MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达显著低于正常早期妊娠组(P<0．05)，因此推测, MMP-9、MMP-2的表达下降，导致滋养细胞的浸润能力显著低于正常早孕, 有可能导致绒毛不能正常侵入子宫壁, 引起血管重铸异常, 绒毛缺血缺氧, 促进了自然流产的发生。
二、ER、PR、MMP与异位妊娠的研究
（一）ER、PR与输卵管妊娠的研究
　　正常情况下,孕卵是在雌、孕激素比例适当的情况下,由输卵管平滑肌和纤毛协同作用送入宫腔,这一平衡的破坏可致异位妊娠[52]。从事临床病理的免疫组织化学专家［53,54,55］ 认为，在输卵管妊娠时，由于输卵管管壁较薄，内膜的蜕膜反应差，输卵管ER、PR的表达较弱，所以用米非司酮治疗异位妊娠的疗效并不十分有效。国内以正常宫内孕子宫蜕膜组织及正常输卵管组织作为对照，对来自手术切除的输卵管妊娠组织进行了比较系统的研究。在显微镜下观察了输卵管妊娠时输卵管的组织病理学改变，采用免疫组织化学和图像分析技术检测ER和PR的表达水平，图像分析结果显示：与正常妊娠时输卵管壶腹部比较，输卵管壶腹部妊娠时，粘膜皱襞变宽，可见二级分支，输卵管粘膜上皮细胞变低矮，固有层间质细胞变大，类似子宫蜕膜细胞，但比子宫蜕膜细小，排列不整齐。输卵管腔内见可见典型的蜕膜细胞和绒毛膜组织。但滋养层细胞发育较差，两层滋养层细胞不明显，其中轴的结缔组织成分较少，且分布稀疏。输卵管妊娠时ER和PR阳性表达的平均光密度及阳性面积百分率，均强于正常输卵管粘膜组织中的表达，但弱于正常早孕子宫蜕膜组织中的上皮（以子宫腺上皮为主）细胞核及蜕膜细胞核的阳性表达，差异均有显著性(P<0.05) ［56］。
　　王学慧等［57］研究显示：ER、PR, 尤其PR在正常分泌期输卵管中的阳性表达率较高, 与分泌期子宫内膜中ER和PR表达水平降低的变化恰好相反；而输卵管妊娠时其黏膜上皮的ER、PR，尤其PR 的表达率显著下降, 与着床窗期子宫内膜中ER、PR表达下降相一致。其研究结果提示, 在生理状态下,分泌期输卵管ER、PR 的强阳性表达, 犹如一层防护屏障, 延迟输卵管黏膜的发育和成熟, 使其与胚泡的发育不能同步, 避免输卵管着床的发生。当某些因素使分泌期输卵管黏膜ER、PR 表达下降时(病理状态)，输卵管黏膜失去了防护屏障, 腺细胞分泌活动增强, 促进输卵管黏膜的分化, 从而使着床物质表达增强, 发生了类似于分泌期子宫内膜的变化, 为胚泡着床准备了有利的条件, 导致与宫内着床相似的输卵管着床的发生。另有相关研究亦表明［58］，妊娠输卵管黏膜组织ER 和PR 含量较低, 导致输卵管发育和肌层蠕动功能与生殖活动不相适应, 使得受精卵滞留于输卵管, 可能是发生输卵管妊娠的因素之一。
（二）MMPs与输卵管妊娠的研究
　　Kucera等[59]对异位妊娠的研究表明，滋养层细胞表达MMP1、MMP2及TIMPs,这些分子参与异位妊娠的早期植入。秦力等[60]研究表明，MMPs2、9、14和TIMP1、2、3于所有绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)中均有表达，从孕3～9周， EVCT细胞中MMP9、TIMP1、TIMP3信号有增强的趋势，TIMP2有下降的趋势，而MMP9,和MMP14则未见变化。表明各种MMPs和TIMP在滋养层细胞浸润过程中发挥各自不同的作用，输卵管壁间质细胞及上皮细胞表达TIMP的较少，可能与输卵管妊娠缺乏蜕膜化反应相关。在输卵管妊娠时，由于输卵管管壁较薄，内膜的蜕膜反应差，MMPs\TIMPs的表达失常可能是输卵管妊娠受精卵着床的可能机制。
　　对于输卵管妊娠的病因，目前比较明确能够影响受精卵进入宫腔的因素就是输卵管炎症, 尤其是慢性输卵管炎。细胞因子及炎症介质对MMPs基因转录的影响是最重要的, 同时它也可能调节TIMPs[61]。何萍等[62]实验显示：在输卵管炎症时输卵管粘膜上皮细胞MM P- 9和TIMP- 1的表达强度与输卵管妊娠相似, MMP-9表达较强, T IMP- 1表达较弱。且与正常组和宫内早孕组比较差异有显著意义。其推测: 在慢性输卵管炎时产生大量的巨噬细胞和中性粒细胞, 分泌的许多炎症介质可从基因转录水平影响MMP- 9 和T IMP- 1的表达[60], 使输卵管粘膜上皮细胞表达过高的MMP- 9, 过多地水解细胞外基质, 破坏输卵管壁的上皮细胞, 使上皮细胞纤毛消失,输卵管皱襞粘连, 管腔变狭窄而不规则；而TIM P-1较低的表达, 减少了拮抗MMP- 9作用。当卵子受精后, 较大的受精卵通过狭窄而不规则的通道将遇到阻碍, 延长了在输卵管中运行的时间, 因而受精卵尚未到达宫腔就已发育到一定程度以致不得不在输卵管内着床而发生输卵管妊娠。梁琴等[63]实验表明，MMP-2, MT1-MMP在输卵管炎和输卵管妊娠中表达强度，与TIMP-2 相反，其与正常输卵管相比有显著差异。亦提示输卵管的慢性炎症会引起MMP-2 的激动剂MT1-MMP 表达增强, MMP-2/TIMP-2 之间的动态平衡失衡,从而可能参与了输卵管妊娠的发生。

第五节  中医体质研究
一、中医体质的概念
　　目前，中医体质学说以王琦教授研究[？]的最为深入，其已形成系统的理论。王琦教授认为，体质是指人体生命过程中，在先天禀赋和后天获得的基础上所形成的形态结构、生理功能和心理状态方面综合的、相对稳定的固有特质，是人类在生长、发育过程中所形成的与自然、社会环境相适应的人体个性特征；表现为结构、功能、代谢以及对外界刺激反应等方面的个体差异性，对某些病因和疾病的易感性，以及疾病转归中的某种倾向性，具有相对稳定性和动态可变性的特点[64]。中医学认为“阴平阳秘，精神乃治”，此即正常生理状态人的健康状态。然而绝对的阴平阳秘是难以做到的，大多数人的气血津液及阴阳均在一定范围内有所偏颇，即为体质偏颇状况。各种体质的人对疾病的易感性均不同，形成疾病后所表现证候亦有所不同。东汉医圣张仲景所著《伤寒杂病论》虽未记载“ 体质”二字, 然论中强调“ 男子”与“ 妇人”体质有别。提出“ 平人”与“ 强人” , “ 盛人与瘦人”区分体质强弱, 并突出了“ 亡血家” 、“ 汗家” 、“ 湿家” 、“ 中寒家”等病理体质的特点, 以此作为对某些致病因素的易感性、病证类型倾向性和治法用药的依据。
二、中医体质研究的意义
（一）中医体质与疾病防治
　　中医体质是相对稳定的个体特性，但它也具有一定的可变性和可调性，而通过改善体质，有助于有关疾病的预防。祖国医学十分重视治未病的思想，《素问?四气调神大论》中云:“圣人不治已病，治未病。夫病已成而后药之，乱已成而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎”，强调了“治未病”的重要性。从《内经》提出“治未病”开始，标志着我国医学的发展已从被动治疗提高到主动预防的水平。

　　《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006－2020年)》中将“人口与健康”作为重点领域之一,明确提出“疾病防治重心前移,坚持预防为主、促进健康和防治疾病结合。研究预防和早期诊断关键技术,显著提高重大疾病诊断和防治能力”,为我国新时期医疗卫生事业的开展指明了方向。如何有效利用现有的医药卫生资源,满足全国人民的医疗和健康需求,对包括中医药学在内的医学科学提出了新的命题和要求。北京中医药大学以王琦教授为首的体质研究课题组制定的《中医9 种基本体质分类量表》和《中医体质分类判定标准》，正符合目前的这一需求。

　　应用《中医9 种基本体质分类量表》和《中医体质分类判定标准》进行受试个体的体质辨识和健康评估，根据个人体质可以分为正常体质和偏颇体质。正常体质相当于健康，偏颇体质相当于亚健康。亚健康人群经现代医学检测，指标一般正常，或仅有某些指标出现轻微的异常，但尚未达到临床疾病的诊断标准。对于这部分人群，尚不需要对其进行药物治疗，但放任其发展，最终很可能发展成为某种疾病。此时，我们可以根据中医体质辨识对其进行健康干预，有助于早期发现和早期预防疾病,降低个人的健康风险和疾病发生率,降低国家医疗费用,全面提高个人和社区的健康水平和生活质量。

（二）中医体质在孕期检查中的作用

　　我国是世界人口最多的发展中国家, 围生期疾病的发生以及新生儿出生缺陷和发病率均较高, 给国家和家庭造成了沉重的社会和经济负担。近年来，随着计划生育政策的执行，优生优育这一观念逐渐深入人心。在这一方面，现代医学先进的检测技术发挥了重要作用。各个家庭通过孕前检查及时发现夫妻双方的异常，通过产前检查及时发现胎儿的异常，在很大程度上减少以上疾病的发生率, 提高出生人口的素质。

　　但是，现代医学只能检测到明确的病变，它不能判断夫妻双方的身体及心理状态对妊娠的影响。临床上由于夫妻双方孕前没有打好体质基础，怀孕后出现先兆流产或自然流产，或发育异常等病例数不胜数，对家庭造成了沉重的精神压力和经济负担，甚至还可能引发一系列家庭问题，给社会带来不稳定因素。如果将中医体质学说应用于孕前保健，开展女性孕前中医体质保健, 对偏颇质进行调理，对上述疾病的易感体质进行干预进而纠正，为育龄产妇打造良好的体质康复基础，进一步做到优生优育，就能够从根本上提高中华民族出生人口素质，推动中华民族的健康事业, 也是推动中医走向世界，让世界人民认识中医，认可中医的重要方式。

　　已有研究表明[65]，早期先兆流产的发病与妇女体质类型相关，阳虚、气郁、气虚和阴虚体质与本病的发生关系最为密切。其证候类型与体质类型存在相关性，体质决定患者的证候类型，并影响着证候的演变和发展。通过中医药调整妇女体质的偏颇，对易感体质进行早期干预，有望成为预防早期先兆流产的有效途径。裴振安等[66]根据气血及阴阳偏颇, 将男性育前中医体质分为气阴质、气阳质、血阴质、血阳质、津液阴质、津液阳质及常质7型，其建议在中医基本理论、中医体质学说理论的指导下, 从“ 辨体质” 角度上运用中医药以使“ 阴平阳秘, 神形合参” , 对男性育前具有养生保健、防病治病的作用, 为优生优育奠定基础。

　　临床上，有不少患者第一次怀孕即为异位妊娠。而目前尚未见到宫外孕患者中医体质的研究报道。对宫外孕患者根据《中医9 种基本体质分类量表》和《中医体质分类判定标准》进行受试个体的体质辨识，统计其体质倾向。以此为依据对计划怀孕的妇女进行体质辨识，对易感体质进行早期干预以预防宫外孕的发生，此研究具有积极的社会意义和经济效益。
 
第二章   临床研究
一、研究内容和目的
　　通过对异位妊娠住院病人进行问卷调查，以研究异位妊娠妇女的体质类型分布，找出其中的规律，探索异位妊娠发病的高危体质。以期通过中医药干预和调节育龄期妇女的孕前体质，降低异位妊娠的发病率。
二、研究对象
（一）病例来源
    2011年1月至2012年3月于广州中医药大学第一附属医院妇科住院的异位妊娠病人。
（二）病例选择
1.诊断标准
（1）有停经史（个别无明显停经史），下腹疼痛（小部分可无下腹疼痛），或有不规则阴道流血。
（2）妇科检查：子宫常大或略大，一侧附件或可触及包块，有压痛。
（3）β-HCG阳性。
（4）盆腔B超：宫内未见孕囊，宫旁出现液性或混合性回声区，或该区有胚芽或原始心管搏动；或宫旁回声区无输卵管妊娠声像特征，但腹腔内存在无回声暗区或直肠子宫陷凹处有积液。
（5）诊断性刮宫及病检未见绒毛。
2.纳入标准
（1）符合诊断标准（1）～（4）。
（2）参考诊断标准（5）。
3.排除标准
（1）不符合诊断标准和纳入标准者。                                                             
（2）合并其他疾病的患者。
（3）输卵管妊娠合并宫内妊娠者。
（4）资料填写不全者。
三、研究方法
(一)体质类型
　　体质类型参照王琦的体质九分法(见附录一)
(二)调查方法
　　根据王琦的体质九分法统一设计的中医体质调查表，选取异位妊娠妇女作为调查对象，进行现场问卷调查。问卷时注意环境、方式，保证保密，尽可能达到100%应答率，填写完毕当场回收调查表。
(三)体质分型及评定标准
　　主要依据王琦的体质九分法分类进行分型、评定。(具体评定标准见附录二、三)
四、数据管理与统计分析

　　采用双人数据输入。计量资料以均数士标准差(？？牙土.)表示，计数资料以百分比(%)表示。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用卡方检验。
　　二分类资料与影响因素之间的关系用Logistic回归分析，其中OR表示的意义为:0R>l，该协变量是一个危险因素；OR<1，该协变量是一个保护因素；0r=1，该协变量对其影响较小。
　　数据统计工作应用美国SPSS12.0统计软件进行数据统计。
五、研究结果及分析
（一）异位妊娠组中医体质调查  

　　本次调查共发放调查问卷178份，入院诊断为异位妊娠者经初步排查后发放调查问卷，根据出院诊断再次筛查。其中住院期间检查发现阴性梅毒者2例，乙肝携带者3例，肝内胆管结石并肾结石者1例，手术治疗中发现合并子宫内膜异位症（主要为盆腔内膜异位）者6例，子宫小肌瘤者4例，卵巢浆液性囊腺瘤者1例，双卵巢囊肿2例，均予以剔除，最后收集有效病例151份。
1.年龄情况
   年龄最小16岁，最大41岁，18～25岁所占比例最高。

表1  异位妊娠组患者年龄分布

图1  异位妊娠组患者年龄分布

 图１中年龄的表示按表１改
2.异位妊娠患者体质类型分布
（1）各种体质分布情况
　　在159例异位妊娠患者当中，阳虚质居多，共72例，约占45.28%，其次为气郁质，共68例，占42.77%，再次为瘀血质，共55例，占34.59%，湿热质和气虚质、阴虚质、痰湿质分别占28.93%、23.27%、23.27%和16.98%。特禀质2例，占1.32%。平和质共17例，占10.69%。
表2  异位妊娠组中医体质分布

 图2  异位妊娠组中医体质分布

（2）单一体质与混合体质的对比
　　在159例异位妊娠患者当中，单一体质者共56例，约占35.22%，混合体质者107例，占64.78%，混合体质当中，2种混合体质者41例，占25.79%，3种混合体质者31例，占 19.50%， 4种混合体质者30例，占18.87%，5种混合体质者2例，占1.26%。
表3 异位妊娠组单一体质与混合体质分布

（3）2种以上混合体质对比
　　各种体质均有相兼，两种以上混合体质中，两种体质相兼频率最高者为阳虚兼气郁质，共29例，占18.24%，其次为瘀血兼气郁质，共22例，占13.84%，再次为阳虚兼瘀血质和湿热兼气郁质，均为23例，各占14.47%。接下来频率较高者为阳虚兼湿热质，共17例，占10.69%。频次较高者还有痰湿兼气郁质，痰湿兼湿热质，湿热兼瘀血质，痰湿兼与瘀血质等。

表4 异位妊娠组两种混合体质分布

（4）3种以上混合体质对比
　　三种以上混合体质中，三种体质相兼频率最高者为阳虚、湿热兼气郁质，共8例，占5.03%，其次为阳虚、瘀血兼气郁质和湿热、瘀血兼气郁质，各6例，均占3.77%，再次为痰湿、湿热兼气郁质，共5例，占3.14%。接下来频率较高者为痰湿、湿热兼血瘀质、阳虚、痰湿兼湿热质、阳虚、痰湿兼气郁质，共4例，均占2.65%。

表5 异位妊娠组三种混合体质分布

（二）正常非孕期妇女中医体质调查
　　共发放调查问卷122份，其中包括在校大学生26人，在校研究生8人，本校及本院员工16人。其他是什么人？？
(一)年龄情况
　　年龄最小17岁，最大43岁，18-25岁所占比例最高。

表6  正常非孕期妇女年龄分布　年龄表示同前改

2.正常非孕期妇女体质类型分布
（1）各种体质分布情况
　　在122例异位妊娠患者当中，阳虚质居多，共45例，约占36.89%，其次为气虚质，共41例，占33.60%，再次为气郁质，共35例，占28.69%，其次为痰湿质、阴虚质、平和质、湿热质、瘀血质和特禀质。
表7  正常非孕期妇女中医体质分布

（三）两组中医体质分布对比
　　两组间年龄分布均衡，比较P>0.05，具有可比性。
对调查资料经Logistic回归分析，对异位妊娠的发生有显著影响的变量有阳虚质和痰湿质(P<0.01)。
表8  组体质类型例数及构成（％）比较

六、讨论
（一）异位妊娠患者体质以偏颇质偏多，体质多为混合质 
　　在159例异位妊娠患者当中，阳虚质共72例，约占45.28%，其次为气郁质，共68例，占42.77%，瘀血质、痰湿等体质分布较多，平和质患者仅10.69%，可见偏颇体质容易有患病倾向，反之平和质患病的可能性较小。异位妊娠患者单一体质 仅占1/3左右，大部分患者兼有2到4种混合体质，切阳虚、气郁、瘀血质比例较高，可见异位妊娠患者体质多为虚实杂志，这一发现在临床上具有积极的指导意义，即我们在针对异位妊娠患者的保守治疗中，在活血化瘀消癥散结的同时，尚需兼顾其虚实夹杂的内在本质，兼以扶助正气。
（二）提倡孕前体质调查，及时纠正偏颇质
　　目前，临床上普遍认为异位妊娠发病的重要原因是输卵管炎，导致受精卵移行受阻而在输卵管内着床发育。对于有异位妊娠病史的患者提倡计划怀孕前行子宫输卵管造影，以检查输卵管通畅与否，预测是否有再次宫外孕可能。但在目前，第一次妊娠即为异位妊娠者的患者亦不少。因此，对尚未有过孕史的人群，对预防异位妊娠疾病的发生而例行进行子宫输卵管造影显然是过激的，而为了对这种潜在的异位妊娠患者进行孕期体质调查，发现其体质偏颇，并指导其通过饮食、药物及生活方面的调理而进行纠正，对于降低异位妊娠的发病率无疑有着积极的意义。而对于既往有异位妊娠病史的患者，在例行输卵管造影检查的同时，进行孕期体质调查，及时纠正偏颇体质，在优生优育，提高母儿的身心健康亦有者积极的影响。
　　赵颖等人通过大量的临床调查表明，阳虚质是自然流产的危险因素，自然流产患者当中阳虚质、气郁质、气虚质、阴虚质、血癖质者比例较高。而我们此次的调查表明，瘀血质和湿热质是异位妊娠的危险因素，异位妊娠患者当中阳虚质、气郁质、血癖质者、湿热质和气虚质比例均较高。综合两者的研究结果，可以看出，阳虚质、气郁质、气虚质、血癖质者发生异常妊娠的可能性较大。为了真正做到优生优育，提高我们人口素质，应提倡对适龄者开展中医体质调查。

第三章 基础实验研究

　　本实验拟通过高效液相--质谱联合分析方法（HPLC-MS）分别对化瘀消癥杀胚的宫外孕复方进行中药复方指纹图谱分析、对灌服宫外孕复方的SD大鼠血清及空白SD大鼠血清进行检测并定性差比分析，作为血清药理学运用的质控方法，证明大鼠含药血清的有效成分群的存在。
用经质控证实含有化瘀消癥杀胚有效物质的大鼠含药血清，对符合纳入条件的输卵管妊娠患者的输卵管妊娠滋养细胞进行体外培养，并分别设MTX对照组及空白对照组进行体外培养。采用实时荧光定量（Real-time）测定化瘀消癥杀胚的宫外孕复方对与输卵管妊娠着床的相关调节因子ER、PR、MMP表达的影响 ，从分子基因水平上系统探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞靶器官的可能作用机制。
总实验路线图：

备注：滋养细胞的培养部分主要由2011届博士研究生袁烁完成；
　　在滋养细胞的鉴定中，本人完成电镜观察，进行形态学鉴定部分。其余鉴定部分主要由2011届博士研究生袁烁完成。

第一节  中药复方的HPLC指纹图谱研究
一、 仪器与器材
（一）仪器  岛津LC-20AB高效液相色谱仪，二元高压泵，紫外检测器，岛津色谱工作站，METTLER  TOLEDO  AG285分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），电热套（山东邺城仪器公司）。
（二）试剂  甲醇（色谱纯），冰乙酸（分析纯），超纯水（18.2MΩ）。

（三）材料 从广州中医药大学第一附属医院药学部购置中药材，药材经广州中医药大学中药学院李耿老师鉴定质量合格。
试验用药材产地及批号如下表：

 二、试验方法
（一）色谱条件
　　日本GL公司C18液相色谱柱（4.6 mm*250mm，5 μm）；流动相A为0.4%乙酸溶液，B为甲醇，进行梯度洗脱；流速1.0 mL/min；进样量20μL；紫外检测波长270nm。洗脱梯度如下：

（二）溶液制备
1.对照品溶液的制备
　　精密称取丹酚酸B对照品5.97mg置25.0mL容量瓶中，加10ml水溶解用甲醇定容至刻度，即为对照品溶液（0.2mg/mL），经0.22 μm微孔滤膜过滤后取20ul上机分析。
2. 供试品溶液的制备
　　准确称取复方中的各位药材30g，放入烧瓶中，加1050ml水煎煮，沸腾后继续加热保持微沸30min，过滤，药渣加450ml水二次煎煮，沸腾后继续加热保持微沸20min。过滤，合并二次滤液，用旋转蒸发仪浓缩后定容至500ml，精密量取浓缩液10ml,用甲醇定容至25ml充分混匀后即为供试品溶液。静置取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后取20ul上机分析。
三、方法学考察
（一）精密度试验
按2.2.2项中方法，制得对一批供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件，连续进样5次，每次20μL。所得保留时间和峰面积与参照峰的保留时间和峰面积相比较后，得相对保留时间和相对峰面积，各峰相对保留时间RSD值均小于1.6%，相对峰面积RSD值均小于5%。
（二）稳定性试验
按2.2.2项中方法，制得对一批供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件，在0、1.5、3、6、9、12、24h分别进样20μL。所得保留时间和峰面积与参照峰的保留时间和峰面积相比较后，得相对保留时间和相对峰面积。各峰相对保留时间RSD值和相对峰面积RSD值均小于5%。具体结果如下：
（三）重现性试验
　　精密称取同一批药材5份，按“2.2.2”项下方法制备样品后，在“2.1”项下色谱条件，进样20μL，测得相对保留时间和相对峰面积，各峰相对保留时间RSD值均小于2.4%，相对峰面积RSD值均小于5%。具体结果如下：
四、结果
　　按上述方法制备复方中药供试品溶液，按上述色谱条件分析，得HPLC色谱图，综合比较分析后，中药复方指纹图谱出峰较多，其中有6个峰与标准品对照，其滞留时间完全一致。瓜氨酸在检测中未出峰，考虑其与紫外吸收不明显有关。

五、讨论
(一)中药高效液相指纹图谱
　　中药是一个极其复杂的化学体系，其化学成分众多, 而中药复方的组分不仅仅是单味药物组分的叠加，其成分在煎煮或提炼加工的过程中相互作用而发生了转化，因而其成分更加复杂。测定少数几种有效成分或指标成分不足以确保药材或制剂的质量, 而指纹图谱即消除了这一缺陷。指纹图谱能全面反映所含成分, 更加有效地体现中药成分的整体性。其具有系统性、特征性和重复性，显示中药质量控制标准的整体性与模糊性[67]，更具有科学性，因而受到国际上的认可。
　　中药指纹图谱分为中药化学指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学指纹图谱中以色谱法最为常用，尤其是高效液相色谱法，为目前中药质量控制的主要手段。高效液相色谱法( HPLC) 是依据各成分在流动相和固定相之间分配系数的不同而进行分离的, 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器, 使分析速度快、分离效率高、灵敏度高和操作自动化。本研究亦采用HPLC对活血化瘀消癥杀胚中药复方进行成分的定性鉴定。
（二）单味药的化学成分研究
　　丹参[68]：为唇形科植物，丹参的干燥根及根茎，其形状与人参相似，因其根皮丹而肉紫，故名丹参，别名紫丹。药理实验证实，脂溶性成分和水溶性成分是丹参活性成分的主要构成，脂溶性成分包括：丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ等，水溶性成包括：有丹参素、丹酚酸、迷迭香酸、原儿茶醛、迷迭香酸等，活性较强的有丹酚酸B。2005版药典规定丹参酮ⅡA 含量不得少于0.20％，丹酚酸B的含量不得少于3％。在中药的鉴别上，药典中以丹参酮ⅡA和丹酚酸B为对照品。
　　赤芍[69]：赤芍为毛茛科植物芍药或川赤芍的干燥根。化学研究发现赤芍中化合物种类较多，主要含有单萜类，如芍药苷、芍药醇、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、PGG、羟基芍药苷、4-乙基-芍药苷、没食子酰芍药苷、芍药苷元酮、芍药新苷等等。2005版药典规定芍药苷的含量不得少于1.8％。在中药的鉴别上，药典中以丹参酮ⅡA和丹酚酸B为对照品。
桃仁[70]：桃仁又名桃核仁，为蔷薇科植物桃或山桃干燥成熟种子。桃仁中的主要化学成分为苦杏仁甙，其他化学成分包括各种油脂。
　　紫草[71]：为紫草科植物新疆紫草或内蒙紫草的干燥根。紫草的有效化学成分是一类脂溶性很强的萘醌类色素, 主要包括: 紫草素、去氧紫草素、乙酰紫草素、β-羟基异戊酰紫草等，其次, 还有多糖、酚类化合物、生物碱等多种成分，其主要有效成分为左旋紫草素。2005版药典规定左旋紫草素的含量不得少于1.8％，紫草干燥品中ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量不得少于0.30％，药典中以左旋紫草素和ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁为对照品。
　　天花粉：为葫芦科植物瓜蒌的干燥根。目前其药效成分研究较多的是天花粉蛋白。2005版药典中以瓜氨酸为对照品。
　　本实验即以丹参酮ⅡA和丹酚酸B、芍药苷、苦杏仁甙、左旋紫草素和ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁以及瓜氨酸为对照品，对活血化瘀消癥杀胚中药复方进行HPLC检测以进行定性鉴定。
（三）活血化瘀消癥杀胚中药复方的高效液相指纹图谱
　　本实验对活血化瘀消癥杀胚中药复方的高效液相指纹图谱检测，方法学考察结果表明:该实验方法的重现性良好，相对保留时间的RSD小于3%，各共有峰相对峰面积的RSD小于3%；仪器的精密度高，精密度实验中各共有峰相对保留时间的RSD小于1%，相对峰面积的RSD小于1%，样品在24小时之内稳定性良好，各共有峰相对保留时间的RSD小于2%，相对峰面积的RSD小于2%。
　　实验证明，中药复方指纹图谱出峰较多，其中有6个峰与标准品对照，其滞留时间完全一致（瓜氨酸在检测中未出峰，考虑其与紫外吸收不明显有关），证明活血化瘀消癥杀胚中药复方含有上述成分。在复方干预细胞有效的情况下，可以推测上述组分可能为复方的显效成分，后继实验可以进一步开展体内化学成分的研究，使中药体外化学成分与其药效真正结合起来，进而阐明活血化瘀消癥杀胚中药的药效物质基础及作用机理的。

第二节 含药血清的制备与 LC-MS/MS法检测
化瘀消癥杀胚中药复方给药血浆的药物成分
一、含药血清的制备
　　以宫外孕I号方加味（丹参、赤芍、桃仁、紫草、天花粉），分为高、中、低剂量组饲养大鼠，并设立甲氨喋呤组及生理盐水组作为对照组，制备含药血清并保存。
（一） 材料与方法
1.材料
1.1实验用药物
（1）中药饮片同“复方中药指纹图谱实验”所用药材，均购自广州中医药大学第一附属医院药学部，产地、批号见表10。
（2）注射用甲氨喋呤：广州中医药大学第一附属医院药学部提供，江苏恒瑞医药有限公司，批号：10050211，规格：100mg/瓶。
（3）生理盐水、水合氯醛等均为广州中医药大学第一附属医院药学部提供正品药物。
1.2实验动物
　　健康雌性未孕SD大鼠30只，体重220g-240g，周龄12-15周。广东省医学动物实验中心提供，合格证号：0064134。
　　饲养条件：SPF级SD大鼠饲养在广东省医学实验动物中心SPF级实验室I，动物实验环境设施合格证号：SYXK（粤）2008-0002，室内保持20-25℃，湿度40～70%。自由饮水、进食，采用12h：12h昼夜间断照明，每周换水3次，换垫料2次，水料充足，SPF级饲料产自广东省医学实验动物中心。
2.方法
2.1中药复方制备
　　化瘀消癥杀胚复方水煎剂：按《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表》换算，化瘀消癥杀胚复方水煎剂大鼠灌胃剂量是1.5g生药/100g体重。中药为广州中医药大学第一附属医院中药房一次性提供的正品中药，三层纱布包裹后，蒸馏水500ml浸泡30min，文火煎取150ml，煎煮三次，混合煎取液，水浴浓缩成剂量为1.5g/ml的药液，-20℃保存备用。

2.2含药血清的制备
（1）动物与分组
取健康雌性未孕SD大鼠30只，随机分成中药7天组-高剂量，6只；中药7天组-中剂量，6只；中药7天组-低剂量，6只；生理盐水组，6只；甲氨喋呤组，6只（详见图9）。
（2）给药方法
①中药中剂量组所用药物血清的供体大鼠灌胃量按以下方法计算：根据王力倩[83]等提出的参考公式：给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数×培养基内血清稀释度，计算给药剂量。

　　大鼠理论等效剂量是人的单位体质量剂量的6.25倍[176]（样品的总生药量为人的一日服用量，按公斤体重公式：，拆算大鼠的等效剂量，作为给药剂量）。药物血清稀释度为5，所以单位体质量大鼠每次灌胃估计量为人的单位体质量剂量的31.25倍，计算后每只大鼠每次灌胃量约为1.5ml（5.4g/ml）。
②甲氨喋呤组大鼠予正常喂食7天，至第7天空腹12小时后肌注甲氨喋呤1mg/只（参照“动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表” [176]计算所得）。
③生理盐水组大鼠予正常喂食及喂服0.9%氯化钠液7天。
（3）血清采集
　　末次给药1小时后在麻醉下行腹主动脉采血，将同组大鼠血清混合，56℃，30分钟灭活处理。22μm微孔滤膜过滤、除菌，-20℃保存，以备体外培养绒毛滋养层用。
备注：此部分实验由本人及2011届博士研究生袁烁共同完成。
二、LC-MS/MS法检测化瘀消癥杀胚中药复方给药血清的药物成分
　　本实验在中药混合对照品的指纹图谱的基础上，应用中药血清药物化学方法，对化瘀消癥杀胚中药复方给药后大鼠含药血清的成分进行分析，以对含药血清中的药物成分进行鉴定。
（注：本实验分别检测中药7天高、中、低剂量组的大鼠含药血清，以及甲氨蝶呤组、生理盐水组大鼠含药血清。）
（一）仪器与试剂
1. 仪器   Finnigan TSQ型三重四级杆液质联用仪，配有电喷雾离子化源（ESI），四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器和柱温箱（美国赛默飞世尔科技有限公司），SB2512型超声波清洗仪（宁波新芝公司）。5417R型高速冷冻离心机，eppendorf（Germany）。
2. 试剂  色谱纯甲醇（美国天地公司），超纯水（实验室自制，18.2MΩ）,色谱纯甲酸（美国天地公司），对照品清单见上节。
（二）方法
1.色谱条件  分析柱为菲罗门C18柱（100mm×2mm,4um）；流动相为甲醇-1%甲酸水（70:30，V/V）；流速为400ul/min；进样量为10ul。
2.质谱条件  离子源为电喷雾离子化（ESI）源；喷雾电压3700V；加热毛细管温度为350℃，鞘气流速为35L/min，辅助气流速为5L/min；检测方式为正离子多离子反应监测，用于定量分析的离子碎片及条件分别为：

3.样品处理   取血清400ul，加入提取试剂甲基叔丁基醚2ml，涡旋混合1min，超声10min，静置10min，取上清液，挥干后加入200ul流动相溶解，取上清液10ul进样。
（三）结果
　　分别取混合对照品溶液和各组血清进样测定，结果如下；各标准品的1级、2级质谱或色谱图见附图。
　　对比各标准品及各组血清的1级、2级色谱的离子流图，我们发现，在7天低剂量组血清中找到瓜氨酸、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁、丹参酮ⅡA及丹酚酸B，在7天中、高剂量组血清中找到瓜氨酸、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁、苦杏仁苷、芍药苷、丹参酮ⅡA及丹酚酸B。甲氨蝶呤组和生理盐水组的含药血清的不含有上述任何一种药物成分。

（四）讨论
1.中药复方含药血清的研究
　　目前，绝大多数中药及复方都是采用传统的口服给药的方式。中药所含成分极其复杂，中药口服给药后，经消化道的作用，部分成分发生了改变，药物成分有的被排泄，有的被选择性吸收，经肝脏作用后进入血液，通过血液运输到各器官组织或作用靶点而发挥作用。因此，不论中药含有多少成分，只有进入血液的成分才可能成为有效成分(外用药及直接作用于胃肠道的药物除外)。含药血清中含有的有效成分包括原形成分、代谢产物及内源性产物。因此，通过分析口服给药后含药血清中的成分，确定中药及复方在体内的直接作用物质，是研究确定中药药效物质基础的一种有效途径。中药复方含药血清质谱图，反应了复方进入体内的化学成分的分布、数目等，它的建立为中药药效物质基础的确认提供了依据。
2.化瘀消癥杀胚中药复方给药后大鼠含药血清的成分分析
　　在相同色谱及质谱条件下,可以通过与对照品溶液中色谱峰的保留时间、紫外光谱图、一级质谱、二级质谱图和多重反应检测色谱图相对照，以检测样品中是否含有对照品所示物质。对比各标准品及各组血清的1级、2级色谱的离子流图，在7天低剂量组血清中找到瓜氨酸、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁、丹参酮ⅡA及丹酚酸B，在7天中、高剂量组血清中找到瓜氨酸、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁、苦杏仁苷、芍药苷、丹参酮ⅡA及丹酚酸B。总体上判断，在化瘀消癥杀胚复方中药的含药血清里，瓜氨酸、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、苦杏仁苷及芍药苷以原形存在，而左旋紫草素在进入体内后，可能经过代谢其存在方式发生了转变。早在1997年，即有研究表明，左旋紫草素[72]进入体内后发生一系列生物转化，生成其他多种代谢产物。紫草的另一主要成分ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁在中药含药血清中有检测到，因此可以判定，中药含药血清的药物来源中确实有紫草。因此，经过液质联用对化瘀消癥杀胚中药复方含药血清的定性鉴定，我们可以初步判定，中药含药血清中确实存在化瘀消癥杀胚复方所有药物成分（丹参、赤芍、桃仁、紫草、天花粉），进而说明，中药含药血清的药物来源于丹参、赤芍、桃仁、紫草、天花粉（当然，目前检测的缺陷是尚不能证明中药含药血清中只由上述五味药组成而不含有其他药物成分。在确定中药含药血清中只由上述五味药组成而不含有其他药物成分这一要求上，尚需对中药含药血清质谱图的各个峰的性质进行鉴定，尤其是与标准品对照不相符的各峰进行性质鉴定，以确定为某种成分以及他的药物来源）。
甲氨蝶呤组和生理盐水组的含药血清的质谱图表明其不含有上述五味中药的药物成分。未见两组的质谱图？？
　　前面所述，在7天低剂量组血清中找到瓜氨酸、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁、丹参酮ⅡA及丹酚酸B，在7天中、高剂量组血清中找到瓜氨酸、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁、苦杏仁苷、芍药苷、丹参酮ⅡA及丹酚酸B。7天低剂量组未检测到的苦杏仁苷及芍药苷，在7天高剂量组中均检测到。这可能是由于低剂量组中苦杏仁苷及芍药苷的血药浓度较低，低于HPLC-MS/MS的最低检测限，导致未检测到，在7天高剂量组中其血药浓度已到达或超过HPLC-MS/MS的最低检测限，故而能检测到。
3.化瘀消癥杀胚中药复方含药血清成分分析可在目前研究基础上进一步深化
　　目前，我们对化瘀消癥杀胚中药复方含药血清的成分初步进行了定性分析，在此基础上，我们尚有很大的深入研究的空间。在选择最佳的色谱和质谱条件的基础上，对中药含药血清质谱图中出现的各个峰的进行全面、具体的定性分析，尤其是与标准品对照不相符的未知成分（可能为药物原形成分的代谢产物或药物引起的内源性产物）进行性质鉴定，确定为某种物质以及它的药物来源。在全面认识活血化瘀消癥杀胚中药复方含药血清的药物成分的基础上，进一步深入研究寻找其有效成分，使中药体外化学成分与其药效真正结合起来，进而阐明活血化瘀消癥杀胚中药的药效物质基础及作用机理的。

第三节 滋养细胞的培养及鉴定

　　本研究选取临床未服用药物，直接行手术治疗的输卵管妊娠患者的输卵管妊娠部位绒毛组织，进行滋养细胞体外培养和鉴定。
一、材料与方法
（一）材料
1.实验材料
0.25%胰酶，吉诺生物（USA）；
胎牛血清，GIBCO（USA）；
牛血清白蛋白，GIBCO（USA)；
DNA酶，吉诺生物（USA）；
BIO-AMF-2滋养层专用培养基，Bioind （以色列）；
超净水，电导平18-2（自制）；
异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗人细胞角蛋白18（anti CK-18-FITC）（北京博奥森）；
荧光素（CY3）标记抗人波形蛋白（anti Vim-18-CY3）（北京博奥森）；
总β亚单位人绒毛膜促性腺激素测定试剂盒（化学发光法）（美国贝克曼）；
秋水仙素（sigma）；
Giemsa染料（sigma）；
激光共聚焦专用皿；
无水乙醇等分析纯；
眼科剪，眼科镊；移液器，无菌枪头；
培养瓶，培养皿，75%酒精等一批。
2.主要仪器设备
317型 CO2培养箱，Thermo（USA）；
SW-CJ-IF型 净化工作台（苏州净化）；
21-R型 冷冻离心机，Thermo（USA）；
1.6-R型 冷冻离心机，Thermo（USA）；
TD25-WS型 自动平衡离心机（长沙湘仪）；
CX5PRO型 电热恒温箱（苏州江东）；
LSM-710型 激光共聚焦显微镜，ZEISS（GER）；
TS100型 倒置显微镜，Nikon（JP）；
E200型 三目显微镜（Nikon，JP）；
    DXI 800型 全自动化学发光免疫分析仪（Beckman USA）。
3.培养条件
培养液为BIO-AMF-2滋养层专用培养基，pH值7.0-7.2，于37℃，5%CO₂条件下培养，每日观察细胞生长情况，当细胞长满瓶底90%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。
（二）方法
1.滋养细胞的原代培养
（1）取材，将输卵管妊娠的绒毛组织置于PBS液中充分洗涤3次，仔细去除蜕膜及血污。
（2）在无菌操作台，将剩余组织剪碎至1mm³左右，约1ml，收集至离心管中，加入等体积0.25%胰蛋白酶液。
（3）于37℃水浴中振荡消化约10min。
（4）900转离心10分钟，弃上清。
（5）将剩余组织轻吹打混匀后均匀铺入培养瓶中，加入1ml BIO-AMF-2滋养层专用培养基。
（6）37℃二氧化碳培养箱中培养1小时后取出，吸出上清及漂浮组织转入离心管中。
（7）离心后弃上清，将剩余组织轻吹打混匀后均匀铺入培养瓶中，加入1ml BIO-AMF-2滋养层专用培养基。
（8）1小时后吸去上清及漂浮组织，离心管收集，离心后弃上清，将剩余组织轻吹打混匀后铺入新培养皿中。
（9）加入1ml BIO-AMF-2滋养层专用培养基，培养1小时后再补入3ml 2ul双抗。置二氧化碳培养箱中继续培养。
2.差异贴壁法分离滋养细胞
（1）在细胞贴壁生长良好的培养瓶中，加入0.25%胰酶消化5min，加培养基终止消化，离心弃上清。
（2）铺入新培养瓶中，加培养基3ml，轻轻吹打后，静置20min。置倒显微镜下观察，成纤维细胞贴壁（稍加摇荡也不浮起），由于成纤维细胞比上皮细胞贴壁快（成纤维细胞的贴壁时间为数十分钟，而滋养细胞贴壁时间为l-2h），此时贴壁细胞主要为成纤维细胞，上皮细胞大多悬浮在培养液内，将培养液收集于另一培养瓶中。重复3次，后铺瓶，置于CO²培养箱中，2日后观察。
（3）观察可见大部分细胞伸展呈圆形，5、6天后，细胞数量增多，呈三角形，连接成片，部分呈长梭形。
（4）待细胞长满瓶底90%左右时，用含0.02%的Na2EDTA和0.25%的胰酶消化液传代。
（5）传代，部分冻存。
3.人输卵管妊娠绒毛滋养细胞的传代培养
当细胞长满瓶底90%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化，计数板计数，达到1.0×10⁷个/ml时分开以5.0×10⁶个/ml接种于培养皿中继续传代培养。
4.细胞扩增
用0.25%胰蛋白酶消化，计数板计数，达到1.0×10⁷个/ml时分开以5.0×10⁶个/ml接种于培养皿中继续培养。细胞培养数由5皿扩增成10皿，继续后续实验。
二、细胞鉴定
（一）通过免疫荧光激光共聚焦显微镜扫描法鉴定
　　采用直接免疫荧光双标显微技术检测FITC标记的CKl8和Cy3标记的波形蛋白，在激光共聚焦显微镜下可见细胞胞浆中有丝状绿色荧光的为CKl8阳性信号，胞浆包膜染色；未见红色荧光的波形蛋白信号，说明分离的细胞中无间质细胞生长，见下表。未见图？？

（二）通过细胞的分泌功能鉴定
　　6例体外培养的滋养细胞，1.0×10⁶/cells，传代培养24h，在换液时留取培养液，检测绒毛膜促性腺激素（HCG）含量。检测结果：绒毛膜促性腺激素（HCG）的最高值为19.43 IU/L/1.0×10⁶cells，最低为1.92 IU/L/1.0×10⁶cells。
（三）通过细胞的电镜观察鉴定
1.在上述细胞爬片的基础上配包埋剂：包埋剂spurr需提前3-4天配，催化剂要在其它的溶液混合搅拌2小时以上后再加，然后再充分搅拌2小时左右（慢速搅拌，避免产生气泡），用封口膜封好，4度冰箱放置3－4天就可使用。
2.固定 样品用锋利的刀片快速切成1立方毫米大小的小块，2.5％的戊二醛（0.1MPBS配）固定过夜。
3.固定样品用的戊二醛，用0.1M PBS缓冲液（PH=7.2）浸洗三次，每5～10min换一次。
4.锇酸后固定60min，4度冰箱放置。锇酸有毒，具挥发性，易伤粘膜，应在通风橱内操做。
5.吸出锇酸，用0.1M PBS缓冲液（PH=7.2）浸洗三次，注意吸干净管盖的液体，每5～10min换一次，锇酸废液应及时加入乙醇，使其沉淀回收。
6.吸弃PBS，依次加入30%、50%、70%、80%、95%丙酮室温放置脱水，每次15min。
7.丙酮室温脱水两次，每次10min。
8.吸弃部分丙酮，滴入包埋剂，丙酮：包埋剂约=1：1，37℃保持2hour。
9.吸弃丙酮包埋剂混合液，加入丙酮：包埋剂约=1：4混合液适量，37℃放置过夜。更换纯包埋液 45℃ 烘箱 放置2 小时。
10.将样品名称或编号写在打印纸上，正面向上放入包埋板的小孔中。往包埋板内倒入少许包埋剂。用牙签挑起一小块样品放到包埋板内,每一孔的两端各放一小块。然后将包埋剂倒满包埋孔,尽量避免产生气泡。
11.包埋聚合：45℃ 烘箱 聚合3小时， 65℃烘箱 聚合48小时。
　　电镜观察结果：滋养细胞形态学未写？？
备注：滋养细胞的培养和免疫荧光激光共聚焦显微镜扫描法鉴定、滋养细胞分泌功能测定主要由2011届博士研究生袁烁完成（滋养细胞的生长曲线、分裂指数及具体的免疫荧光激光共聚焦显微镜扫描法流程详见袁烁博士的毕业论文）。本人在上述基础上进行了滋养细胞的电镜观察以对滋养细胞进行形态学鉴定。

第四节 化瘀消癥杀胚复方
对输卵管妊娠滋养细胞ER、PR、MMP的影响
一、研究目的与内容
　　用经质控证实含有化瘀消癥杀胚有效物质的大鼠含药血清，对符合中医药治疗的早期输卵管妊娠患者的输卵管妊娠滋养细胞进行体外培养，并分别设立甲氨蝶呤SD大鼠含药血清及空白SD大鼠含药血清体外培养的输卵管呢绒毛滋养细胞作为对照组，通过采用实时荧光定量（Real-time）测定化瘀消癥杀胚的宫外孕复方对与输卵管妊娠着床的相关调节因子ER、PR、MMP表达的影响 ，拟从分子基因水平上系统探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞靶器官的可能作用机制。

二、材料与方法
（一）材料
　　共18个样本，分为对照组，中药组，甲氨蝶呤组3组，每组6个样本，分别检测ER，PR，MMP2，β-actin四个基因，β-actin为内参基因。各个基因因为均为上海生工合成，均为2OD。

（二）试剂
　　RNA提取试剂盒为TIANGEN? RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒，cDNA第一链合成试剂盒为TAKARA PrimeScript? RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒，REAL-TIME PCR试剂盒为TAKARA SYBR? Premix Ex TaqTM II试剂盒。
（三）仪器
　　THERMO Legend Micro 21R离心机，Jenway Genova超微量核酸蛋白检测器，Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪。
（四）方法
　　RNA提取，cDNA第一链合成，REAL-TIME PCR均按照试剂盒说明书方法。
1.RNA提取方法
操作步骤：
（1）匀浆处理：
每10-20 mg 组织加300 μl 裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），用研磨杵将组织彻底研磨（如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器）；随后向匀浆液中加入590μl RNase-free ddH2O 和10 μl 蛋白酶K，混匀后56 ℃处理10-20 分钟。
注意：组织量一定不要超过20mg，否则将导致RNA得率和质量下降。
（2）12,000 rpm(~13,400×g)离心2-5 分钟，取上清进行以下操作。
（3）缓慢加入0.5 倍上清体积无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3 中（吸附柱放在收集管中）， 12,000rpm (~13,400×g)？？离心30-60 秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
（4）向吸附柱CR3 中加入350μl去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)？？离心30～60 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
（5）DNase I 工作液的配制：取10 μl DNase I 储存液放入新的RNase-free 离心管中，加入70 μl RDD 溶液，轻柔混匀。
（6）向吸附柱CR3 中央加入80 μl 的DNase I 工作液，室温放置15 分钟。
（7）向吸附柱CR3 中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)离心30～60 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
（8）向吸附柱CR3 中加入500 μl 漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇）， 室温静置2 分钟，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60 秒，弃废液，将吸附柱CR3 放回收集管中。
（9）重复步骤8。
（10）12,000 rpm(~13,400×g)？？离心2 分钟，倒掉废液。将吸附柱CR3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：此步骤目的是将吸附柱CR3 中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT 等实验。
（11）将吸附柱CR3 转入一个新的RNase-free 离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100 μl RNase-free ddH2O ， 室温放置2 分钟，12,000rpm(~13,400×g)？？离心2 分钟，得到RNA 溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA 溶液请于-70℃保存。
2.cDNA第一链合成方法：

反转录反应条件如下: 37℃ 15 min *3（反转录反应），85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）
3.REAL-TIME PCR方法

PCR扩增程序：
Stage 1：预变性
Repeat：1
95℃ 10秒
Stage 2：PCR反应
Repeat：40
95℃ 5秒
60℃ 20秒（测发光强度）
Stage 3：
Repeat：1
95℃ 15秒
60℃ 60秒
溶解曲线：
65℃～95℃每30秒上升0.5℃
三、结果
1.ER的表达 
　　分析均取△△Ct（ddct），即各组与内参基因比较后，再与对照组相比较，因此所作分析均为相对表达分析。对照组的相对表达量为1.00E+00。
（1）各组各例ER的表达：

（2）各组含药血清对滋养细胞ER表达的影响
　　研究发现，中药中剂量组和甲氨蝶呤组米非司酮??能显著下调ER的表达，见表？？。甲氨蝶呤组与生理盐水组相比，ER的表达更低，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；中药中剂量组与生理盐水组相比，er的表达更低，差异具有统计学意义（p<0.05）；甲氨蝶呤组与中药中剂量组相比，er的表达略低，差异无统计学意义（p>0.05）。
表16  三组含药血清对ER表达的影响

　　甲氨蝶呤组米非司酮？？能显著下调ER的表达，与对照组相比P<0.01，中剂量中药能显著下调er的表达，与对照组相比p<0.05，中药组与西药组对比无显著差异。< p="">

2.PR的表达：
（1）各组各例PR的表达：

（2）各组含药血清对PR表达的影响
　　中剂量中药和米非司酮??能显著下调PR的表达，见表??。甲氨蝶呤组与生理盐水组相比，PR的表达更低，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；中药中剂量组与生理盐水组相比，pr的表达更低，差异具有显著统计学意义（p<0.01）；甲氨蝶呤组与中药中剂量组相比，pr的表达略低，差异无统计学意义（p>0.05）。

　　米非司酮??能显著下调PR的表达，与对照组相比P<0.01，中剂量中药能显著下调pr的表达，与对照组相比p<0.01，中药组与西药组对比无显著差异。< p="">

3.MMP的表达：
（1）各组各例MMP的表达：

（2）各组含药血清对MMP表达的影响
　　中剂量中药和米非司酮??能显著上调MMP的表达，见表??。甲氨蝶呤组与生理盐水组相比，MMP的表达明显上升，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；中药中剂量组与生理盐水组相比，mmp的表达上升，差异无统计学意义（p>0.05）；甲氨蝶呤组与中药中剂量组相比，MMP的表达上升，差异无统计学意义（P>0.05）。这可能与本研究样本量较少有关，如加大样本量或许能更明确中药对MMP-2的影响。

四、讨论
（一）ER、PR与流产的相关性
　　众所周知，雌、孕激素对维持妊娠、促进胚胎发育起着至关重要的作用,这些激素水平下降, 必将导致流产、早产的发生。雌、孕激素的生物活性有赖于激素和靶组织受体的相互作用，雌激素在转录水平诱导ER、PR产生，使ER、PR表达上调，而孕酮可在转录和转录后水平使两者下调，两者保持动态平衡和精细的比值以维持继续妊娠[40]。
    目前，关于异位妊娠绒毛组织中ER、PR的表达我们尚未查阅到相关文献报导，目前研究较多者为难免流产、自然流产患者蜕膜组织中上述指标的[73,74]显示其蜕膜组织中ER、PR的表达明显低于正常早孕者，流产大鼠模型[75,76]与正常怀孕大鼠相比亦如此；关于宫内妊娠予米非司酮药物流产的患者[77,78,79]，大多数研究发现，米非司酮能显著下调蜕膜中ER、PR的表达，与自然流产者相似。其抗早孕机理为抑制蜕膜组织孕激素受体、使局部孕激素下降, 颗粒细胞释放松弛素, 导致网状纤维溶解坏死而终止早孕。也有研究发现[80,81]，米非司酮能使蜕膜中ER、PR的表达升高，尤以前者为甚。其认为，服用米非司酮后引起ER升高，可能是其具拮抗孕酮的作用引起，验证了孕期孕激素分泌增多是引起低ER水平的主要原因。另有报道[82]米非司酮使蜕膜组织中ER上升，PR下降。
关于自然流产患者、米非司酮药物流产患者绒毛组织中ER、PR的表达的文献报导较少。2000年，杨雪峰[83]等研究表明正常早孕绒毛中存在ER、PR，其与刘颖、蒋晓莉[84]等分别实验证实服用米非司酮后绒毛中ER、PR均无表达或表达明显下降，认为米非司酮可直接作用于绒毛，表明米非司酮可以在受体水平拮抗孕酮，具有促进缄毛滋养细胞变性、坏死及凋亡的作用，从而达到抗早孕的目的。
（二）MMP与流产的相关性
　　受精卵着床以后，胎盘的形成是妊娠维持的关键。而胎盘形成过程中, 绒毛外滋养细胞对蜕膜的侵入以及对子宫螺旋小动脉的“血管重铸”是胎盘建成的关键环节。其中，滋养层细胞依靠自分泌和蜕膜组织协调分泌的蛋白水解酶及其抑制因子的协调作用,穿过子宫内膜上皮及血管基膜，进而在母体组织中迁移和浸润。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一类重要的肽链内切酶，其直接作用于蜕膜间质、基底膜和血管腔面附着物，几乎可降解所有的细胞外基质成分,为滋养细胞侵入清除了物理障碍。宫内妊娠[85,86]滋养层细胞及母体蜕膜细胞均表达MMPs2、9、14和MMPs抑制因子TIMP1、2、3。其中MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)具有水解IV 型和V 型胶原的作用，是滋养细胞侵袭的关键酶；IV 型胶原是细胞外基质的主要成分，尤其是蜕膜血管基膜的IV 型胶原的改变会显著影响妊娠时滋养细胞对母体子宫的侵入。Kucera等对异位妊娠的研究表明，滋养层细胞表达MMP1、MMP2及TIMPs，这些分子参与异位妊娠的早期植入。MMPs的合成受多种因素的影响[87]，其中孕激素能抑制MMPs的表达及活性水平。
　　目前，关于异位妊娠绒毛组织中MMPs的表达我们尚未查阅到相关文献报导。
　　目前研究涉及到的有自然流产者绒毛组织中上述指标的表达。关于MMPs在自然流产者绒毛组织中的表达尚有分歧，Iwashashi 等研究了自然流产蜕膜组织中胶原的含量, 发现IV型和V 型胶原的含量明显低于正常分娩者, 因此推测IV型和V型胶原含量的降低是由于MMP-2 和MMP-9过量表达的结果。Jokimaa、谭兵兵、王乾兴等分别检测到绒毛组织中MMP-2的表达量明显高于人工流产组(P<0.01)，MMP-9无明显差异，提示自然流产组MMP-2处于高表达状态。因此推测, 在早孕期内, 由于MMP-2 活性增高又导致子宫蜕膜基质降解过度, 从而使尚未完全形成的胎盘从宫腔的剥离提前发生, 可能是早期自然流产发生的原因之一；而张素娥等检测到绒毛组织中MMP-2的表达量明显低于正常早孕组(P<0.01)，张宏等检测到早期自然流产组绒毛组织的MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达显著低于正常早期妊娠组(P<0．05)，因此推测, MMP-9、MMP-2的表达下降，导致滋养细胞的浸润能力显著低于正常早孕, 有可能导致绒毛不能正常侵入子宫壁, 引起血管重铸异常, 绒毛缺血缺氧, 促进了自然流产的发生。
　　王萍等[88]对服用米非司酮进行药物流产者及直接进行人工流产者的绒毛组织及蜕膜组织进行检测和对比，结果显示，服用米非司酮者，其MMP-9的表达明显增强（P<0.01）,TIMP-1的表达明显减弱（P<0.01），其推测米非司酮终止早孕的机理可能与MMP-9、TIMP-1密切相关。米非司酮可能导致绒毛滋养细胞和蜕膜细胞合成和分泌MMP-9升高，TIMP-1降低，MMP-9/TIMP-1比值升高，其动态平衡被打破，使得滋养细胞的侵袭性增强，MMP-9对蜕膜细胞外基质成分过度降解，导致绒毛、蜕膜组织不同程度变性、坏死，干扰了胚胎着床，引起流产的发生。
（三）化瘀消癥杀胚中药对输卵管妊娠的可能作用机制
　　本研究以符合保守治疗而要求手术治疗的输卵管妊娠患者手术中取得的绒毛组织培养的滋养细胞为研究载体，分别以生理盐水（对照组）、中剂量中药、米非司酮？？进行干预，以MMP-2、ER、PR为检测指标来研究活血化瘀消癥杀胚中药对输卵管妊娠的影响。研究发现，中剂量中药和米非司酮能显著下调ER的表达（P<0.01）,中药组与西药组对比无显著差异；中剂量中药和米非司酮？？能显著下调pr的表达（p<0.05）,中药组与西药组对比无显著差异；中剂量中药和米非司酮？？均能上调mmp-2的表达，其中，米非司酮？？与对照组相比具有显著差异（p<0.05），中药组与米非司酮组？？对照无明显差异（p=0.53）。由此推测：活血化瘀消癥杀胚中药能上调mmp-2的表达，使输卵管蜕膜组织过度溶解，从而使尚未完全形成的胎盘从输卵管管腔剥离；同时它能下调pr、er的表达，从受体水平拮抗孕酮，从而促使缄？？毛滋养细胞变性、坏死及凋亡，从而达到杀胚作用。
结  语
一、结论
　　受精卵在子宫腔以外着发育床称为异位妊娠，包括输卵管妊娠，宫颈妊娠，宫角妊娠，腹腔妊娠，其中以输卵管妊娠最常见[1]。近年来，由于人工流产手术增多[2]，患者趋于年轻化，有不洁的性生活、盆腔感染史和盆腔手术史患者增多，异位妊娠发病率明显增加，据资料统计，异位妊娠发病率占所有已知怀孕总数的1%[3]以上。   
　　异位妊娠患者的中医体质有何偏颇，其易感体质是哪种，如何在孕期检查发现其易感体质同时加以调整，以降低异位妊娠的发病率；中医药在异位妊娠的治疗上有其优势所在，其作用机制如何，这些都需要通过大量的临床调查及实验研究支持。本文围绕异位妊娠患者的中医体质和输卵管妊娠的中医药治疗，从临床和基础实验两个方面进行了探讨。
本研究得出如下结论：
1.阳虚质、气郁质、血瘀质、湿热质等是异位妊娠的高危体质。
2.异位妊娠患者的体质多为虚实夹杂。
3.活血化瘀消癥杀胚中药复方的高效液相指纹图谱表明，其中药复方内含有组方的所药物成分（丹参、赤芍、桃仁、紫草、天花粉）。
4.LC-MS/MS法检测化瘀消癥杀胚中药复方含药血浆药物成分的实验证实，中药含药血清中含有上述化瘀消癥杀胚的中药成分。这些成分是化瘀消癥杀胚中药治疗输卵管妊娠的药效基础。
5.化瘀消癥杀胚中药复方能降低ER、PR的表达，表明其能从受体水平拮抗雌孕激素，导致绒毛组织变性、坏死。是其发挥消癥杀胚效应的作用机制之一。
６.化瘀消癥杀胚中药复方能上调MMPs的表达，加速输卵管蜕膜的溶解，导致蜕膜组织变性、坏死。也是其发挥消癥杀胚效应的作用机制之一。
二、不足与展望
1.不足之处
(l)部分异位妊娠患者在住院过程中存在紧张和消极情绪，体质调查条目较多，进行调查时患者有时可能存在不耐烦，故问卷的应答率虽有100%，但其真实性可能受一定影响，并且调查显示气郁质比重较大，可能与此也有一定的相关性。以后建议对患者直接采用《中医体质分类判定标准》进行问卷，患者可以回答问题后直接自己进行判断。因其对自身身体状况较为关心和好奇，故应当可以提高患者答卷的认真程度，提高调查的可靠性。
(2)本研究纳入对象均为广州中医药大学第一附属医院妇科的输卵管妊娠患者，研究结果可能受到病例所处的地域环境和生活习惯影响，其他区域的异位妊娠患者体质倾向仍需大量的临床调查来证实。
(3)本研究纳入对象为2011.1一2012.3的异位妊娠患者及正常的非妊娠期妇女，因收集病例时间较短，样本量收集有限。
(5)本研究观察的是活血化瘀消癥杀胚复方（宫外孕I号方加味）的作用机理，对于该方内各个单药的药物机理及各个药物各自的作用机制有待于进一步研究。
2.展望
(1)目前，我们对异位妊娠患者的中医体质偏颇及其易感体质进行了调查，可以继续深入研究如何对偏颇体质进行药食及生活方面的孕前调理，以真正起到降低异位妊娠发病率的作用。
(2)本研究采用HPLC-MS/MS对活血化瘀消癥杀胚复方（宫外孕I号方加味）及其中药含药血清进行了定性鉴定，可以作为药效学研究的前奏，进一步深入进行中药与疗效的相关性研究。

参考文献　略